[工学]2动物细胞基因工程技术.ppt

动物细胞基因工程技术 2. DEAE-Dextran法 将DNA溶液溶解在TBS〔含Tris、 K＋、Na＋等〕缓冲液中，与二乙胺乙 基葡萄糖（DEAE-Dextran）混合， 滴加到受体细胞表面，供体DNA便会 进入受体细胞。 4. 电穿孔法（electroporation） 将供体DNA与受体细胞混匀，在 高压电场作用下，给细胞一个电脉 冲，引起受体细胞出现瞬间可逆性开 启，外源DNA便乘机通过膜孔进入 细胞。 5. 基因枪法 将DNA与对人类无明显毒副作用而 对DNA有良好吸附能力的微细金粒结合， 在高压电场的作用下，金粒以极高的速度 带入人体外的细胞内或直接带入人体内。 7. 受体介导法 此方法依赖于受体和配体间的特异 结合所介导的细胞内吞作用而将外源基 因导入细胞。一般是将DNA与多聚物 （如多聚赖氨酸）结合而浓缩，再结合 以一定的配体即可用于基因转移。不过 效果仍不理想。 具有复杂的翻译后加工系统 糖基化以及二硫键在合成和分泌过 程中自然而然的正确形成 产生正确折叠和完全生物活性的蛋 白质 瞬时表达 稳定表达 动物细胞基因表达系统 瞬时基因表达系统是一个简单、有效的外源蛋白表达手段，其表达水平最高可以达到稳定细胞表达水平。蛋白质是由未整合的、不复制的质粒DNA产生的，这样使得蛋白质表达的时间相对短，只有48h到7天。 稳定表达系统需要得到稳定转化的细胞株，需要1～2个月的时间，在稳定转化的细胞中，DNA被整合到染色体中，这使得重组蛋白质产物可以一代接一代地产生。 哺乳动物细胞表达系统与特征 表达的蛋白质能正确加工、修饰并折叠； 糖基化等修饰能保证糖蛋白行使功能； 表达产物分泌到培养液，容易分离纯化。 细胞生长缓慢，生产效率较低； 连续细胞系导致了副产物的增加； 对培养条件要求苛刻和敏感； 可能有潜在的致病因子、免疫原性存在； 表达载体的改进和宿主细胞的改造较为复杂。 动物细胞表达系统与特征 昆虫细胞表达系统与特征 安全：杆状病毒无致病性，安全性受FDA认可。 易饲养：饲养，发育快。 高量表达：用强启动子，外源基因可超量表达。 高效表达：可容纳较大的外源基因（12kb） 翻译后的加工使大部分产物显示出良好的活性。 重组率低，筛选困难，周期长。 外源基因的表达在转染的晚期，这对表达不利。 糖基化等加工途径与哺乳动物细胞不完全相同 构建高效表达载体：病毒载体，质粒载体 转染动物细胞：人源细胞株系，哺乳动物细胞株系，昆虫细胞株系 筛选鉴定：选择剂，报告基因 获得生产用工程化细胞系 基因工程动物细胞系的构建 质粒穿梭载体 质粒的转染方法 磷酸钙共沉淀法 DEAE-Dextran法 3. 脂质体转染法 4. 电穿孔法 5. 基因枪法 6. 超声波法 7. 受体介导法 1. 磷酸钙共沉淀法 把供体DNA溶解在HEPES溶液中，然后缓慢加入Na2HPO4-CaCl2溶液，供体DNA便被包裹在磷酸钙溶液中，这种共沉淀可被细胞吞噬，外源基因便导入了受体细胞。 3. 脂质体转染法 脂质体是由磷脂、胆固醇或其它脂类形成的一种可以高效包装DNA的人造单层膜。其结构和性质与细胞膜极为相似，因而二者易于融合，DNA则由于细胞的内吞作用而进入细胞。 脂质体+无抗、无血清1640 质粒+无抗、无血清1640 孵育20min 与细胞（4-6х105/ml）混合+无抗、有血清1640 4-6小时补充正常培养基、24小时加G418 6. 超声波法 超声波可对细胞膜直接作用，使细胞膜的通透性增高，DNA 可通过扩散作用进入细胞。本法对于悬浮和贴壁生长的细胞均适用，并且超声波可通过培养瓶瓶壁发挥作用。 *