[工学]6基因功能研究技术2011.ppt

GST融合蛋白沉降技术 利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲 和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作 用蛋白。 蛋白质芯片技术 蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的 相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质 芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可 以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相 互作用蛋白点。 等离子表面共振技术 将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米 级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过 时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折 射率上升，导致共振角度的改变。 靶蛋白抗体 固体基质 待筛选蛋白 低离心力沉淀或微膜过滤 亲和反应 反应体系 靶蛋白抗体 待筛选蛋白 相互作用 沉淀得到待筛选蛋白 图 6-22 免疫共沉淀示意图 免疫共沉淀技术：将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法 在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。 6.3.4. 细胞内蛋白质相互作用研究——荧光共振能量转移法（FRET） 当一个荧光分子（又称为供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（又称为受体分子） 的激发光谱相重叠时， 供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光， 同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。 FRET荧光能量转移有三个基本条件： 给体与受体在合适的距离（1～10 nm）； 给体的发射光谱与受体的吸收光谱有 一定的重叠（这是能量匹配的条件）； 给体与受体的偶极具有一定的空间取向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。 6.3.5 RNAi技术 近年来的研究表明，一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰(RNA interference,RNAi，也译作RNA干预或者千涉)。 研究表明它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。由于可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，可以毫不夸张地说，RNAi正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命，并将彻底改变这个领域的研究步伐。为此被SCIENCE评为2002年最重要的科研成果之一 研究发现，双链RNA是RNAi的触发物，引 发与之互补的单链RNA（ssRNA, single- stranded RNA）的降解。 经过Dicer（一种具有RNAase III活性的核酸酶）的加工，细胞中较长的双链RNA（30个核苷酸以上）首先被降解形成21～25个核苷酸的小分子干扰核糖核酸（siRNA，short interfering RNA ），并有效定位目标 mRNA。 在起始步骤，加人的dsRNA被切割为21一23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(又被称为引导RNAs)。证据表明:一个称为Dicer的酶，是RnaseⅢ家族中特异识别双链RNA的一员，能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导人的双链RNA，切割将RNA降解为19一21bp的双链RNAs (siRNAs) 。 在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, or RISC )。激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源.RNA转录本上，并在距离siRNA3端12个碱基的位置切割mRNA。研究表明每个RISC都包含一个SiRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。 RNAi作用机 制示意图。 ??? 凝胶阻滞试验（gel retardation assay），又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。 所以，当某个DNA片段与细胞提取物混合之后，若它在凝胶电泳中的移动距离变小了，就说明它可能已与提取物中的某种特殊蛋白质分子相结合了。 6.6.1 凝胶阻滞试验 6.6其他分子生物学技术 凝胶阻滞实验的基本原理图 放射性标记的DNA由于与一种细胞蛋白质B结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带 A C B 放射自显影 * * * * 凝胶电泳 放射性标记的DNA 细胞蛋白质提取物 蛋白质与DNA结合 * * * * * * B DNA-蛋白质结合物电泳迁移缓慢 滞后带表明DNA与蛋白质结合 DNaseI足迹试验 ???