[]脑源性神经营养分子在大鼠骨癌痛中的作用及其神经免疫机制.pdf

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[]脑源性神经营养分子在大鼠骨癌痛中的作用及其神经免疫机制

脑源性神经营养因子在大鼠骨癌痛中的作用及其 神经免疫机制 中文摘要 基于我室改良的骨癌痛模型表明,脊髓 P2X4 特异性存在于小胶质细胞表面,且 其参与骨癌痛大鼠痛觉过敏的形成。此外,近年来研究表明,脑源性神经营养因子 (brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是神经元-胶质细胞间对话的重要信号分 子,这一神经痛后异常分泌的 BDNF 是由小胶质细胞上 P2X4 激活实现的。作为与神 经痛相似又有其独特性的疼痛,骨癌痛状态下尚未发现存在类似 BDNF 介导的改变。 据此,我们推测,脊髓小胶质细胞 P2X4 受体激活介导的 BDNF 释放可能参与骨癌痛 痛敏的发生。本研究将结合在体、离体实验,采用 siRNA、行为学,real-time PCR , Western Blot ,ELISA ,免疫组化等方法,通过分子水平(P2X4 受体和 BDNF )、细胞 水平(小胶质细胞和神经元)以及整体水平(免疫和感觉系统)的对话来初探疼痛 的神经免疫机制。 [关键词] 脑源性神经生长因子(BDNF) ;P2X4 受体;骨癌痛;神经免疫机制;大鼠 第一部分 脑源性神经营养因子参与大鼠骨癌痛的发生 目的和方法 探讨脑源性神经营养因子 (Brain-derived neurotrophic factor,BDNF ) 在大鼠骨癌痛发生中的作用及其神经免疫机制。应用 Walker 256 乳腺癌细胞种植于大 鼠一侧胫骨髓腔,建立骨癌痛模型,并通过疼痛行为学、影像学、病理组织学等评估 肿瘤及疼痛发生发展情况;以下按照下述研究目的进行相应的实验分组,并分别采用 疼痛行为学(n=10 ),Western blots (n=4 ), Real-time PCR (n=4 ),免疫组织化学(n=4 ), 小 RNA 干扰(small interfering RNA ,siRNA ,n=4) 技术以及磺基罗丹明 B (sulforhodamine B,SRB)方法(n=6 )进行研究: ①观察骨癌痛大鼠脊髓及背根神经 节(DRG )BDNF 表达产物的变化;②观察小胶质细胞抑制剂米络环素对骨癌痛大鼠 I 脊髓 BDNF 表达的调节作用及其镇痛效应;③研究 BDNF 中和抗体对大鼠骨癌痛的 镇痛效应及其下游磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶 1/2 (phosphorylation of extracellular signal-regulated protein kinase1/2,p-ERK1/2 )机制;④ 针对小胶质细胞 上 BDNF 表达的 siRNA 筛选及转染复合物的毒性检测;⑤观察 BDNFsiRNA 对骨癌 痛大鼠的镇痛效应及其可能机制。 结果 ①骨癌痛大鼠 L4~6 脊髓后角和 DRG 的 BDNF mRNA 及蛋白表达均增加,且峰值在造模后第 6 天(n = 4, P 0.01) ;② 早 期(造模后第 4~6 天连续注射)鞘内注射米诺环素可明显减缓大鼠骨癌痛(机械撤 爪阈值 PWT 及行走评分 ambulatory scores )(n=10, P0.01) ;并减缓骨癌痛大鼠脊 髓后角的 OX-42 (小胶质细胞激活标志物)和BDNF 的表达;而晚期给药(造模后 第 10~12 天连续注射)则无显著作用;荧光免疫组化显示,造模后第 6 天,骨癌痛 大鼠 L4~6 脊髓后角 OX-42 表达上调;且 OX-42/BDNF 双标产物也上调。③鞘内注 射 BDNF 中和抗体减缓骨癌痛大鼠机械痛敏(机械撤爪阈值 PWT) (n=10 , P0.01) ; 并 显 著 减 少 脊 髓 BDNF 和 p-ERK1/2 的 蛋 白 表 达 (n=4 , 均 P0.01) ; ④LipofectamineTM2000 8µl 复合 100nmol siRNA (脂质体与siRNA 比例为 1:3 ),不 仅细胞毒性低而且转染效率高(n=6 ,P0.01 ),为最佳转染条件;与阴性对照组及 siRNA283、siRNA232 相比,BDNF siRNA1588 (100nmol,脂质体与 siRNA 比例 1: 3 )干扰小胶质细胞

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