[农业]第九章 分子杂交技术1.ppt

第九章 分子杂交技术Hybridization technique 概念： 在DNA与DNA，DNA与RNA之间，存在 着碱基互补的关系，在加热或加入变性剂等条件下，DNA双链之间的氢键被破坏，双链解开成为单链，此时加入有互补序列的DNA或RNA，在一定离子强度和温度下保温，则加入的DNA或RNA可与模板链形成稳定的DNA-DNA或DNA-RNA异源双链，此过程称为杂交。 主 要 内 容 核酸杂交的基本理论 核酸探针 核酸分子杂交方法 蛋白质分子杂交 第一节 核酸杂交的基本理论—DNA的变性与复性 DNA变性 方法 热变性：90~100℃ 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、熔解温度(melting temperature,Tm) DNA复性或杂交(hybridization) ——DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等 核酸分子杂交的原理 一、探针的分类 DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针 切口平移法(nick translation) 随机引物法 聚合酶链式反应法 T4多核苷酸激酶标记DNA5’末端 DNA快速末端标记 化学标记技术:直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上 T4多核苷酸激酶标记DNA5’末端 寡核苷酸探针或短的RNA和DNA探针可选用此法标记，寡核苷酸探针一般多用这种方法标记。在大肠杆菌T4噬菌体多聚核苷酸激酶（T4PNK）的催化下，将γ-32P-ATP上的磷酸连接到寡核苷酸的5’末端上。要求标记的寡核苷酸5’端必须带羟基。反应式为： 三、标记物 放射性同位素 1）灵敏度极高，可以检测10-14~10-18 g 的物质。最适条件下，可以测出样品中少于1000个分子的核酸含量。 2） 放射性核素与相应的元素具有完全相同的化学性质，对酶促反应无任何影响，不会影响碱基配对的特异性、稳定性和杂交性质。 3）特异性高，假阳性结果很少是由于放射性核素引起的。 其缺点是： 1）放射性污染。 2）过强的放射线可以造成核酸分子结构的破坏。 3）半衰期短，标记后立即使用（32P/14.3d 35S/87.1d 3H/12.1y ）。 非放射性探针标记的显色体系 AP显色体系：　　　　 AP BCIP BCI-OH + NBT→紫色↓ BCIP：5溴-4氯-3吲哚磷酸，NBT：四氮唑蓝 HRP显色体系： HRP·H2O2? DAB–2NH2 棕色↓+ 2H+ +H2O ABC显色体系： DNA –B + SA – AP→DNA – B – SA-AP或DNA – B +SA - BAP→DNA –B –SA –BAP 经上述两反应，把AP连接在DNA上以后，再进行AP酶显色。 SA为Streptavidin（链霉亲合素），BAP为生物素化的磷酸酶，B为生物素（ biotin），ABC为Avidin – Biotin - Enzyme complex, 即亲合素- 生物素-酶复合物。B和SA还可以换成DIG和ANTI－DIG 第三节 核酸分子杂交的类型 固相杂交 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization） 斑点杂交（Dot blot） Southern印迹杂交（ southern blot ） Northern印迹杂交（Northern blot） 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization） 液相杂交 2、固相杂交的一般程序 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization） 菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。 Southern 印迹杂交 1975年，英国Southern创建 DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。 Northern 印迹杂交 检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同 靶核酸：RNA RNA电泳 转膜：不需变性 第四节 蛋白质分子杂交 自从1975年苏格兰爱丁堡大学Southern EM 首先提出DNA的印迹术（Southern Blotting)以来，给后人许多的启示，1977年Alwine将此技术应用于RNA的研究——N