[农学]中国农业大学遗传学_09_基因工程和基因组学.ppt

第九章 基因工程和基因组学 第一节 基因工程 （一）基因工程的概念 1. 遗传工程 广义： 细胞工程 如体细胞、原生质体的培养与杂交 细胞器工程细胞核的移植： 回交，克隆羊 染色体工程整条染色体或染色体片断的切割或转移。 基因工程 狭义：基因工程 ：体外不经过有性繁殖，有目的地使DNA发生重 组的技术体系。故又称重组DNA技术。 2. 克隆（clone） n. 无性繁殖系：无性繁殖系，遗传物质来源和组成完全相同。 v. 获得无性繁殖系的过程－即获得某种特异DNA片段，并大量 扩增的过程。 二、基因工程的内容与步骤 三、限制性内切酶 定义：限制性、内切酶 类型： I 型： 特异识别位点，但切割位点随机。需要ATP、 Mg2+等。基因工程中无用：EcoB; EcoK II 型: 特异识别位点和切割位点。只需Mg2+。 识别位点：回文对称序列（palindrome） 粘性末端：EcoR I Hind III：5’突出 Not I Pst I 3’突出 平头末端：Sma I EcoR I: Hind III: Pst I Sma I 四、 载体（vector） 类型：质粒（含粘粒）、病毒（噬菌体）、 YAC、BAC、PAC 等 条件： 1. 具有复制原点（ori），在宿主细胞中能自我复制并带动 外源DNA复制，稳定保持。 2. 具有多克隆位点（MCS－multiple cloning sites ），即 有多种限制酶切位点，各种位点是唯一的，且与载体的 复制原点和标记基因位点无关。 3. 有可以作为重组DNA分子筛选的标记基因。至少一个， 寄主没有这种基因。 4. 容易从寄主中分离回收。 常见的载体 （一）克隆载体 1. 质粒（plasmid） pBR312－缺点：拷贝数低 承载量小：3-4 Kb pUC19 －a. 本身较小：2.6－2.7kb， 可插入5-12Kb b. 高拷贝数：500 c. 可以 LacZ 基因蓝白斑筛选（蓝斑不一定没有插 入，但白斑一定有插入） IPTG?Lac Z表达?X-gal分解?蓝色 2. ? 噬菌体（ ? phage） （1）EcoR I 酶切? 左： 头、 尾 右： 复制、裂解。 中间：去除不影响繁殖、裂解等。 （2）易操作、阳性克隆多 （3）承载15-23 kb 粘粒（柯斯质粒－cosmid） （1） 结构：? 噬菌体cos＋质粒ori ?既可以包装成噬菌体，又可以在细菌中大量复制。 （2） 承载：～50 kb ?克隆真核生物的基因、作图。 4. 穿梭载体（shuttle vector） （1）定义：能在两种不同生物中复制的载体。 一种：原核生物（E.coli） 一种：真核生物 （酵母） （2）结构： 复制原点：ori E.coli ARS（自主复制序列） 酵母（2 ?）