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第五章 DNA的复制(DNA Replication ) DNA复制 亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以各单链 DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP，合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。 复制子(Replicon，复制单位或复制元) DNA中含有一定复制起点和复制终点的复制单位。 复制子的长度大小不均，1.3万—90万bp不等。 DNA的半保留复制（Semi-Conservation Replication） 概念： 复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子代DNA分子 。 理论上DNA的复制也可采用其它方式，如叫全保留复制(conservative replication)和分散模型（dispersive model）的复制方式也是可能的。 第一节 半保留复制的验证 半保留模型（semioconservetive model） 全保留复制模型(conservetive model) 分散模型(Dispersive model)。 验证半保留复制的实验 一、Meselson-Stahl实验 二、Taylar实验 三、姐妹染色单体差别染色方法（sister- chromatid differential staining）5溴脱氧尿嘧啶（5-Bromodeoxy uridine，简称BUdR） 斑色染色体（Harlequin chromosome） 四、Cairns复制模型—θ型复制  图11-4 Taylor 蚕豆根尖放射自显影实验。(a)按半保留复制预期DNA在复制过程中标记情况；(b)实验结果染色体放射自显影的图示。 第二节 参与DNA复制的酶和蛋白 一、快停突变与慢停突变 二、复制的酶系统 （一）DNA聚合酶1.DNA聚合酶的共同特点 （1）需要提供合成模板； （2）不能起始新的DNA链，必须要有引 物提供3－OH； （3）合成的方向都是5‘→3’ （4）除聚合DNA外还有其它功能。 表11-1 E.coli 中的三种DNA多聚酶 复制的特异性（复制的忠实性）： (1)合成前（presynthetic）错误控制：能够通过匹配的化学特点加以识别，检查进入的碱基是否和模板互补，这是一种合成前的预防措施。 (2)校正（proofreading）控制：在新的碱基加到链上以后，来检查碱基是否配对。发生错配时，会把刚加上去的错误碱基切除。 2.DNA聚合酶的结构和功能 DNA聚合酶有6个结合位点： (1) 模板结合位点； (2) 引物结合位点； (3) 引物3‘－OH结合位点； (4) 底物dNTP结合位点； (5) 5‘→3’外切酶结合位点； (6) 3→5校正位点。 3、DNA聚合酶Ⅰ的功能 特点：主要用于DNA的修复和后随链中RNA引物的置换。 使用的模板范围较宽（1）有引物的ssDNA（线状或环状）。（2）有缺口的dsDNA（无论大小）；（3）有切口（nick）的双链DNA。 1. 5‘→3’聚合功能 2. 3‘→5’外切活性 3. 5‘→3’外切活性 (1)切口平移（nick translation）； (2)链的置换； (3)模板转换（template-switching） 4. 内切酶活性 4、DNA多聚酶Ⅲ的结构 DNA pol Ⅲ全酶在DNA上的装配分为三个阶段： （1）一个β二聚体加上一个γ复合体识别引 物模板形成一种前起始复合物。 （2）DNA在于β,γ复合体结合的位点构象 发生改变，而对核心酶产生了高亲和。 使核心酶能与DNA结合。 （3）τ二聚体结合核心聚合酶，使其二聚化。 （二） DNA连接酶 其作用机制是分三步进行： 1、E＋ATP→E－AMP＋ppi 在E.coli中， E＋NAD→E－AMP＋NMN（烟酰胺单核苷酸） 2、E-AMP上的AMP转移到DNA的5‘-PO4上使其活化 3、活化的5‘－PO4与相邻的3’－OH作用形成3‘－5’ 磷酸二酯键，并释放出AMP。 （三） 单链结合蛋白 单链结合蛋白（single strand binding protein,SSB）又称为双螺旋去稳定蛋白（helix destabilizing protein） 由177个aa组成 在E.coli 中以四聚存在 分子量为74KDa ，每个分子可以覆盖32nt 在原核中SSB与DNA结合表现出协同效应。 （1）SSB之间的相互