[农学]第五章 亲和层析.ppt

第五章 亲和层析分离技术 Affinity Chromatography 第一节　亲和层析概述 亲和层析:利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术 历史 1910年就有人用不溶性淀粉选择吸附、提纯淀粉酶，这是最早的基于生物特异性进行分离纯化的实例。 但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。 20世纪60年代末，溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋白质技术的出现，解决了配体固定化的问题，使得亲和层析技术得到了快速的发展。 生物大分子的分离 优点： 1.纯化过程简单、迅速 2.分离效率高 3.实验条件温和 缺点： 1.亲和吸附剂通用性较差。针对某一分离对象就需要制备专一的吸附剂和建立相应的实验条件 2.配体的选择及其与基质的共价结合需 要烦琐的操作步骤 第二节　亲和层析基本原理及理论基础 原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。 亲和力 生物分子间存在很多特异性的相互作用，如我们熟悉的抗原－抗体、酶－底物或抑制剂、激素－受体等等，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。 ?固相化 ? (Immobilise) ? 配体Ligand:亲和层析中能被某一生物大分子识别和可逆结合的生物专一性物质。即被固定在基质上的分子称为配体。 基质Matrix(载体):亲和层析中与配体共价结合,使其固相化的物质。 ?吸附 ?(Adsorption) ? ?解吸 (Elution ) 一、亲和层析基本原理 基本原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。 分离过程 将制备的亲和吸附剂装柱平衡， 当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合（静电引力、范德华力以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上） ，从而留在固定相上 而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。 通过适当的洗脱液（改变起始液缓冲液的pH或增加离子强度或加入抑制剂等因子）将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质 二、亲和层析的特点 分辨率很高 分离速度快 操作简便 对设备要求不高 亲和吸附剂通用性较差 洗脱条件较苛刻 与其他层析技术比较 吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等都是利用各种分子间的理化特性的差异，如分子的吸附性质、分子大小、分子的带电性质等等进行分离。 由于很多生物大分子之间的这种差异较小，所以这些方法的分辨率往往不高。要分离纯化一种物质通常需要多种方法结合使用，这不仅使分离需要较多的操作步骤、较长的时间，而且使待分离物的回收率降低，也会影响待分离物质的活性。 亲和层析是利用生物分子所具有的特异的生物学性质－亲和力来进行分离纯化的。由于亲和力具有高度的专一性，使得亲和层析的分辨率很高，是分离生物大分子的一种理想的层析方法。 三、亲和层析的类型 生物亲和层析 免疫亲和层析 固定化金属离子亲和层析 拟生物亲和层析 生物亲和层析 利用自然界中存在的生物特异性相互作用物质对的亲和层析。 通常具有高的选择性。 典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、激素-受体等。 免疫亲和层析 免疫亲和层析是利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。 例如1：将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。 例如2：在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低，用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离，而亲和层析则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。 固定化金属离子亲和层析 1975年，Poroth首次提出“固定化金属螯合亲和层析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromatography)”的概念，首次成功地在琼脂糖上偶联了螯合剂亚氨基二乙酸(IDA)钠。IDA的钠盐与金属离子如Cu++螯合后，可与生物分子如蛋白质结合，不同的蛋白质与金属离子结合力不同，从而将蛋白质分离。 固定化金属离子亲和层析 固定金属离子亲和吸附剂（IMA）由载体，螯合基和金属离子三部分组成，利用材料上固定的金属离子与蛋白表面的组氨酸等残基配位结合，选择性的吸附蛋白质 。 目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸