[农林牧渔]微生物 10-4、5、6第十章 微生物的遗传变异和育种.ppt

第四节 基因重组和杂交育种 来自不同个体的染色体DNA A和B是如何进行重组的呢? 在真核生物中，基因重组是一个有序过程，经常是作为有性繁殖的一部分发生的。 在细菌中，基因重组发生的形式----转化、转导、接合 原生质体融合(protoplast fusion)：用脱壁酶（蜗牛酶、溶菌酶）处理将微生物细胞壁出去，使菌体细胞在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹的球状体(原生质体)，再用聚乙二醇(PEG)促进（电击促进）原生质体发生融合，两亲本基因组由接触到交换，从而实现基因重组，这一技术叫原生质体融合。 原生质体融合的一般步骤： (1)筛选标记菌株，一般采用营养缺陷性和抗药性等遗传性状 (2)原生质体制备，细菌和防线菌主要用溶菌酶，酵母菌和霉菌一般用蜗牛酶和纤维素酶。 (3)原生质体的融合，分为化学诱导融合（PEG）和物理诱导融合（电诱导）。 (4)原生质体再生 (5)融合子的选择 选择性遗传标记，选择性培养基。 第五节分子育种（基因工程育种） 通过基因工程改变后的菌株被称为“工程菌”，工程菌已逐渐应用于药物的微生物发酵生产中，主要有以下几个方面：①增加生物合成基因量而增加抗生素产量；②导入强启动子或抗性基因而增加抗生素产量；③把两种不同的生物合成基因在体外重组后再导入受体而产生杂交抗生素；④激活沉默基因，以其产生新的生物活性物质或提高抗生素产量；⑤把异源基因克隆到宿主中表达，以期彻底改变生产工艺。 工程菌的稳定性问题 由工程菌产生的珍稀药物如：胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原、人促红细胞生成素、重组链激酶等都已先后供应市场，不仅保证了这些药物的来源，而且使成本大大降低。但工程菌在发酵生产和保存过程中表现出不稳定性，具体表现为：质粒的丢失；重组质粒发生DNA片断脱落；表达产物不稳定。 工程菌的稳定与否，与重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理和遗传性以及环境条件等因素有关。 防止或降低工程菌的不稳定的措施： ①组建合适的载体，引入一段特殊的DNA片断或基因使宿主细胞在分裂时，质粒能较稳定的遗传到子代细胞中； ②选择适当的宿主，相对而言重组质粒在大肠杆菌中的稳定性大于枯草杆菌和酵母； ③施加选择压力，即利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能生长，常用方法有抗生素添加法、抗生素依赖变异法、营养缺陷型法； ④控制外源基因过量表达，外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定； ⑤控制培养条件； ⑥在构建质粒时，插入能改良宿主细胞生长速率的特殊DNA片断； ⑦避免使用带有可转移因子的质粒； ⑧将质粒上的不需要的DNA部分除去； ⑨在发酵过程中将工程菌固定化可以提高工程菌的稳定性。 第六节 菌种的衰退、复壮和保藏 1. 斜面保藏法 将菌种接种于斜面培养基上培养，培养成熟后置于4℃冰箱保藏。是一种短期的菌种保藏方法，广泛用于放线菌、细菌、酵母菌和丝状真菌。 保藏的斜面每隔1-3个月要移接一次，继续保藏；移接代数最好不要超过3-4代。 斜面保藏的不足：菌种生长未停止，可能自发突变；易变异和退化；水分易蒸发，引起菌种退化甚至死亡。 2. 液体石蜡保藏法 直接将无菌无水的液体石蜡加入生长好的菌种斜面上，置于4℃保藏。也是一种斜面保藏法， 优点是防止培养基水分蒸发并隔绝氧气。 缺点是必须直立，占据较大空间。不适于以石蜡为碳源或对石蜡敏感的菌种。 3. 干燥保藏法 ⑴ 砂土保藏法 制作时沙和土以1：1或3：2混合装管灭菌。 优点：经济简便，保存时间长，不易变异。 缺点：不适于担子菌类、只靠菌丝繁殖的真菌、无芽孢的细菌、酵母等。 ⑵ 滤纸条保藏法 将菌体细胞或孢子吸附在湿的无菌滤纸条上，干燥后置于无菌安瓿管中低温保藏。 适合于丝状真菌、酵母菌和细菌的保藏。 4. 冷冻干燥保藏法 用保护剂制备菌悬液，使其在冻结状态下升华其中水分，最后获得干燥的菌体样品。 在真空状态密封瓶口隔绝空气，造成无氧的真空环境，置低温下保存。 优点：保藏时间长，一般5-10年。大多数微生物都可以采用。 我国大多数生物制品菌种都是采用冷冻干燥法保藏。 冷冻干燥保藏法中常用的保护剂 5. 低温保藏法 将孢子或菌丝悬于保护剂（甘油或牛奶）后，直接置于低温冰箱（-25℃以下）