[医学]7 DNA重组技术.ppt

DNA重组技术 李信民 遗传学与分子生物学系 5372009443@ DNA重组 克隆 DNA重组 不同来源的DNA分子，通过磷酸二酯键连接而重新组合的过程，称为DNA重组。 克隆 指由一个细胞经过无性繁殖以后形成的子代群体。构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁殖体的过程叫做克隆化。 重组DNA技术也叫基因工程。 第一节 工具酶 工具酶： 对目的基因进行切割，合成，连接，修饰的酶 主要有 限制酶和修饰酶两类 一限制性内切酶 restriction endonuclease 限制酶的命名： 四个字母+罗马数字 第一个字母：大写 表示该菌的属名 第二、三个字母：小写 表示该菌的种名 第四个字母：（有时无） 表示该菌的株名 罗马数字：酶的编号（按发现的顺序） 限制酶的种类 属DNA内切酶类，均来源于细菌，分三型 在DNA重组中用II型，该酶特点是：有特异识别位点 限制酶的识别位点 通常是4-6个碱基对，具有回文结构序列的DNA片段 有些限制酶识别序列为8个或8个以上碱基对 识别序列短，切点数多，产生的片段小；反之识别序列长，切点数少，产生的片段大 切割位点：大多数酶是错位切割，产生粘性末端，少数酶产生平端或称钝端. 二 修饰酶 对DNA、RNA分子末端进行剪切、补平、连接、化学修饰的酶 1大肠杆菌DNA聚合酶I （全酶） 模板 DNA 底物 dNTP Mg 2+ 合成方向 5’→3’ 外切酶活性 5’→3’ 3’→5’ Klenow fragment： DNA聚合酶I受枯草蛋白酶水解作用而产生（大片段 分子量76kD） 5’→3’聚合酶活性 3’→5’外切酶活性—校正作用 主要作用： 补齐双链DNA的3’末端 标记探针 在cDNA克隆中，合成第二链 DNA序列分析 2 逆转录酶 reverse transcriptase： 常用的有两种：AMV逆转录酶、MMLV逆转录酶 模板：RNA 底物：dNTP 合成方向： 5’—3’ （ 5’—3’RNaseH外切酶活性） 主要作用：合成cDNA，建立cDNA文库 3 T4 DNA连接酶  T4 DNA ligase 主要作用 连接双链DNA 形成3’，5’-磷酸二酯键 4 末端脱氧核苷酰转移酶  TdT 俗称加尾酶 主要作用 将脱氧核苷酸加到DNA的3’-OH 用于探针标记 或形成同聚尾的粘性末端便于连接 5 Taq DNA聚合酶 特点：可耐高温 5’—3’聚合酶活性 3’—5’外切酶活性 主要用途：PCR DNA测序 6 碱性磷酸酶 来源有二：牛，细菌 作用：去除5’-磷 载体 vector 能够携带重组DNA进入宿主细胞，并在其中进行复制和表达的特殊DNA序列。 载体通常分为克隆载体和表达载体 理想的载体：具有自主复制能力；具有较多拷贝数；有足够的容量；单一特异的克隆位点；一个或多个筛选标记；有较高的遗传稳定性。 第二节 DNA重组载体 常用载体 质粒 噬菌体 病毒 一 质粒 plasmid 基本特性： 质粒是细菌细胞内的染色体外的共价闭合的环状DNA分子，能独立进行复制。 可以赋予宿主细胞特定的遗传性状. 只有在宿主细胞内才能复制. 二 质粒的类型 接合型质粒、可移动型质粒和自传递型质粒 严谨型质粒（stringent plasmid）、松弛型质粒(relaxed plasmid) 窄宿主谱及广宿主谱质粒 DNA重组中所用质粒载体多用松弛型质粒改造而成。 质粒载体的特点： 具有松弛型复制子---增殖复制不可少的序列 存在多个单一酶切位点---便于外源序列插入 具有插入失活标记---便于筛选阳性克隆 分子量较小---插入序列小于15kb (一) pBR322： 双链环状，长4363bp 拷贝数高（拷贝数：细菌中的分子个数） 多个单一的限制酶位点 两个抗药性基因标记：四环素抗性基因tetR 、氨苄青霉素抗性基因ampR （外源基因插入失活） 目前已被其它载体所取代 (二) pUC质粒载体系列 pUC18/19：由pBR质粒与M13噬菌体改建而成（二者方向相反） 2.69kb 复制起始点：来自pBR322 氨苄青霉素抗性基因ampR 大肠杆菌半乳糖苷酶基因（Lac Z基因 ）启动子和α肽序列 多克隆位点 pUC质粒载体结构特点: Ori---来自pBR322 Ampr ---无酶切位点 LacZ序列---来自M13 多克隆位点---来自M13 可用蓝白斑筛选 (三) 噬菌体载体 phage 本质为细菌的病毒 ---能自用宿主