[医学]基因工程22.ppt

基因工程 （二） DNA 直接转移法 农杆菌侵染双子叶植物获得转基因植株是非常成功的，但自然界中的农杆菌只侵染双子叶植物，对单子叶植物不敏感。虽然通过添加乙酰丁香酮类物质可使农杆菌侵染单子叶植物，但单子叶植物的再生比较困难，因而农杆菌转化单子叶植物仍然是比较困难的。 超螺旋结构的细菌质粒，虽然不能在植物细胞中复制，但可以重组整合到植物染色体内。受这一现象的启发产生了基因直接转移技术。重组机制并不清楚，因为细菌质粒与植物DNA之间没有同源性，事实上整合是随机发生在植物染色体的任何位点。 DNA 直接转移法种类 基因枪法 原生质体法 脂质体法 花粉管通道法 电激转化法 PEG介导转化方法等。 （1）定义 基因枪法（particle gun）又称微弹轰击法（microprojectile bombardment, particle bombardment, biolistic)。 它是把遗传物质或其它物质附着于高速微弹上直接射入组织、细胞、细胞器内，完成整合并表达的基因转化方法。 “Gene Gun” Technique （2）动力系统 炸药爆破力 高压气体 高压放电 （3）DNA颗粒载体的制备 利用CaCl2对DNA沉淀作用；亚精氨、PEG的 粘附等作用将DNA固定在颗粒表面 。 （4）金属颗粒 金粉： 规则的球形，比表面积大，DNA吸附力强。 钨粉： 廉价，但易在细胞表面形成有害的氧化物。 基因枪转化率 　　基因枪转化率差异很大，一般在10-3~10-2之间（McCabe在大豆上的转化高达2%），相对于农杆菌介导的转化率要低得多，而且基因枪转化成本高；嵌合体比率大、遗传稳定性差。 基因枪法优点：　　a) 无宿主限制　 　b) 受体类型广泛　　c) 可控度高　　d) 操作简便迅速。　　正因为基因枪这些优点，使基因枪成功的应用于：植物基因转化，特别是单子叶植物的转化；外源基因导入植物细胞器；种质转化（茎尖分生组织、配子体、胚胎细胞）；植物基因表达调控研究。 2.多聚物介导转化： 利用多聚物PEG 、多聚赖氨酸、 多聚鸟氨酸等在二价阳离子作用下，促进DNA在原生质体表面形成沉淀，继而通过原生质体的内吞噬作用而被吸收进入细胞内。 磷脂介导（Phospholipids as gene-delivery vehicles） 脂质体(liposomes)是一种人造的脂质小泡，外周是脂双层，内部是水腔。 3.电穿孔法 将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬浮液中，混合物在 200 - 600 V / cm 的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组织培养基中生长 1 - 2 周，再生出整株植物。 Electroporation Technique Microinjection （2）细胞固定（对植物来言）： 琼脂糖包埋法 多聚赖氨酸粘连 吸管支持法 （3）优缺点： 转化率高，10-20%甚至60% 繁琐耗时，需要专门的显微注射仪， 要求精密操作技术和低密度培养技术。 5、花粉管通道法 在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。 该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。 利用花粉管通道将DNA转移至胚囊，转化尚不具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎组织。目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究。 农杆菌介导、基因枪法回顾 采用某种转基因方法处理外植体后，通常外植体中仅有少数细胞获得转化。只有采取有效的筛选方法，才能高效准确地选择到转化细胞。 筛选方法主要有两种： 解毒基因筛选 选择基因为一解毒基因，可以消除培养基中有害物质（如抗生素、除草剂等）对细胞生长的抑制作用；而非转化细胞不能在含有有害物质的培养基中生长。 营养缺陷型筛选 受体细胞为营养缺陷型细胞，不能在选择性培养基中增殖，而选择基因可以补偿这种缺陷，使转化细胞在选择性培养基上正常生长。 二、植物基因工程中的报告基因 报告基因是指其编码产物能够被快速测定、常用于检测外源基因是否成功地导入受体细胞（器官或组织），是否