[医学]第七章 分子杂交.ppt

* * 第七章 核酸分子杂交 核酸分子杂交是指具有一定同源序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成异质双链的过程, 即来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补可形成异源双螺旋，称为核酸分子杂交(hybridization)。具有灵敏度高、特异性强等优点，主要用于特异DNA或RNA的定性、定量检测。 第一节 核酸分子杂交的基本原理 第二节 核酸探针 第三节 核酸分子杂交技术 第一节??? 核酸分子杂交的基本原理 DNA和DNA链、RNA与DNA链或两条RNA链之间，只要具有一定的互补序列均可在适当的条件下发生杂交。常用已知的DNA或RNA的片段作为探针，包括特异的DNA序列，或转录的RNA序列或cDNA序列，或人工合成的寡核苷酸片段。 根据支持物的不同，分为固相杂交和液相杂交。固相杂交又包括膜上印迹杂交和细胞原位杂交两种。膜上印迹杂交即将核酸从细胞中分离纯化后，在体外与探针杂交，细胞原位杂交是在细胞内进行的杂交。 一、杂交的稳定性 不同杂交双链其Tm值不同，影响因素有： (1) 杂交链GC含量愈高的杂交双链其Tm值愈高。 (2)?杂交链愈长其Tm值愈高。 (3)?杂交双链的碱基错配程度。 (4)?溶液的离子强度越大，Tm值愈高。 变性剂可影响碱基堆积力和氢键的形成，可降低Tm值，常用甲酰胺、脲及二甲基亚砜等。用50%的甲酰胺大约可使杂交双链的Tm值降低30℃。 二、杂交动力学 杂交过程的第一步是两条核酸单链随机碰撞形成局部双链，如果此局部双链周围的碱基不配对则会重新解离，继续碰撞，一旦找到正确的互补区，两侧的序列迅速配对形成完整的双链分子，后一步反应是一个自发过程。 影响因素主要有： (1)????探针浓度、长度和复杂性 探针浓度越高，复性速度越快。 探针越长，扩散速度越慢，复杂性越高，配对难度越大。 (2)????离子强度 高离子强度溶液中，其正离子可中和DNA链磷酸基团的负电荷，消除其间的静电斥力，有利于杂交分子的形成。 (3)????温度 通常杂交温度在低于Tm 20~25℃温度下进行。不含变性剂甲酰胺时，大多数杂交反应在68℃进行。当含50%甲酰胺时，在42℃进行。 寡核苷酸探针一般在低于Tm值5℃~10℃下进行。 (4)????杂交促进剂 用硫酸葡聚糖，其微粒的表面可以吸附DNA探针分子，使接触面积增大，有利于杂交反应。 (5)????? 杂交条件的严谨性 所谓严谨性(stringency)，是指杂交反应体系，避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成杂交复合物的严格程度。反应温度升高，离子强度降低，会增加反应的严谨性，适用于匹配好的或序列完全同源的核酸的杂交反应，或用于检测点突变；反之，则适用于匹配差或序列不完全同源的核酸杂交反应。 第二节 核酸探针 核酸探针是指带有放射性同位素、生物素或其他活性物质标记的某种特定的DNA或RNA片段。 一、核酸探针的类型 ㈠ 基因组DNA探针 用克隆化的基因片段作探针应尽可能选用基因的编码序列(外显子)。 ㈡ cDNA探针 与mRNA互补的DNA链称cDNA，特异性高，是一种较理想的核酸探针。 ㈢ RNA探针 RNA探针有下述优点： ①杂交体的稳定性高，杂交反应条件严格，特异性更高。 ②RNA单链不存在双链DNA探针的互补双链的复性，杂交效率较高。 ③RNA无高度重复序列，非特异杂交少。 ④杂交后用RNase消化未杂交的RNA探针，可降低杂交本底。 ㈣ 寡核苷酸探针 寡核苷酸探针是由实验者设计、经核苷酸合成仪人工合成的。 1.探针制备方便，可以根据需要设计合成各种寡核苷酸片段，从基因组DNA文库或cDNA文库中筛选特定的克隆。 2.非常适用于检测已知序列基因中的点突变或定点诱变技术产生的点突变。 3.用新的酶促方法标记可以得到高比活度标记探针。 二、标记物 标记物与探针的结合不影响杂交的特异性和稳定性。 ㈠ 放射性同位素 放射性同位素探针标记物，有高度特异性，缺点是易造成放射性污染，半衰期较短，不能长期存放。常用的有32P、3H、35S，有时也用14C、125I或131I。 ㈡ 非放射性标记物 (1)????? 半抗原 (2)????? 配体 (3)????? 荧光素 (4)????? 化学发光技术 三、探针放射性同位素标记法 ㈠ 放射性同位素的选择 32P、35S或3H均可用于标记DNA或RNA。32P最常用于核酸的标记。35S适用于原位杂交和DNA序列测定。3H放射比活度低，故常用于原位杂交。 ㈡ 核酸探针的标记方法 ⒈缺口平移法(图7-1)