[医学]第十一章 基因重组蛋白包涵体的分离和复性.ppt

生化分离工程第十一章 基因重组蛋白包涵体的分离和复性 包涵体的分离和蛋白质复性 随着基因工程技术的迅猛发展，人们可以在外来宿主细胞中控制目的蛋白质的生产，从而为临床和工业生产提供一些因自然原料缺乏而无法大量获得的蛋白质多肽产品。 迄今为止，人们已经成功地实现了用多种原核、真核表达系统生产基因工程蛋白 补充：蛋白质在E.coli中的表达 E.coli表达系统优点： 操作方便 遗传背景清楚 廉价培养基中迅速生长→发酵成本低、周期短 目的蛋白可获高水平表达 →E.coli是生产重组蛋白的首选表达系统，特别是对那些不需要进行蛋白质翻译后修饰（如糖基化）就具有生物活性的基因工程蛋白 一、包涵体的形成 在大肠杆菌中表达的基因工程蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物 包涵体形成的几种可能性 研究发现：低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成包涵体。 1）少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高，积聚量超过其在细胞内溶解度时沉淀； 2）合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对； 3）蛋白产生量过多，所需其他成分(如折叠酶和一系列翻译后修饰酶及分子伴侣等)不足； 减少包涵体形成的策略 1）降低重组菌的生长温度：较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。 2）添加可促进重组蛋白质可溶性表达的添加剂，如：培养E.coli时添加乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）等。 3）供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。 包涵体加工流程 包涵体的洗涤 为除去包涵体上粘附的杂质，应用洗涤液洗涤包涵体沉淀 常用去污剂Triton X-l00或脱氧胆酸钠和低浓度变性剂（如2mol/L尿素或盐酸胍等，注意：过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解）洗涤以除去脂类和膜蛋白。 如：50mM Tris-HCl， pH7.0-8.5， 2M尿素，1mM EDTA 包涵体的溶解 大多数在pH8的条件下，用强变性剂如8mol/L尿素、 6mol/L盐酸胍，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展 蛋白质复性机理 蛋白质复性过程中，涉及两种疏水相互作用： 一是分子内的疏水相互作用 →促使蛋白质正确折叠 二是肽链分子间的疏水相互作用→导致蛋白质分子间聚集，形成寡聚体和多聚体→再进一步聚集形成沉淀 影响复性效率的因素 1）蛋白质本身的性质 有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11； 一般说来，在优化的条件下，大多数蛋白质体外复性效率在20%左右 影响复性效率的因素 2）蛋白质的复性浓度 I向N的转化是一级反应，而聚沉是二级或多级反应 聚沉的反应速度与蛋白质浓度的平方或高次方成正比 而复性反应过程与蛋白质浓度的一次方成正比，故浓度越大，聚沉反应越明显。 影响复性效率的因素 3）变性剂浓度和复性时间 在高浓度变性剂存在时，蛋白质主要以U存在（6mol/L 盐酸胍、8mol/L Urea等）；在中间浓度时（较低浓度的盐酸胍和Urea），主要以I存在，即能抑制蛋白质分子间的疏水相互作用，又不会妨碍蛋白质分子内疏水相互作用→A方向被阻止。 由于I向N转化是一个慢的过程，当蛋白质在此时放置较长的一段时间，I就可以慢慢地向N转化 影响复性效率的因素 4）氧化还原环境 复性不仅要降低或去除变性剂，同时必须提供SH-氧化形成S-S的环境→合适的氧化还原环境 采用配对的氧化型和还原型巯基物质 配对低分子量巯基试剂包括GSSG/GSH、半胱氨酸或巯基乙醇/胱氨酸等。通常还原型巯基物质的使用浓度为l~3mmol/L，还原型/氧化型的摩尔比为10：1或5：1。 影响复性效率的因素 5）pH和温度 最适宜的复性pH值应大于7.0（一般8.0-9.0），以防止自由SH-的质子化作用影响正确配对的S-S的形成。应避免在蛋白质pI处进行复性（蛋白质的静电排斥力几乎为零，相互间疏水作用区域就容易作用而形成A）。 影响复性效率的因素 6）折叠促进剂 能够促进蛋白再折叠的化学物质统称为折叠促进剂，折叠促进剂的作用原理在于稳定复性蛋白质的天然结构、抑制肽链间的疏水相互作用。 应用于蛋白质复性并具有显著效果的折叠促进剂有表面活性剂、聚乙二醇PFG、L－精氨酸、抗体、分子伴侣等。 包涵体的分离和蛋白质的复性 一般说来，在优化的条件下，大多数蛋白质体外复性效率在20%左右 蛋白质体外复性的常用方法 稀释和透析复性法 折叠促进剂协助复性法：表面活性剂、PEG、分子伴侣等 反相胶团复性法、双水相体系复性法 层析折叠复性（固相复性）：