[医药卫生]PCR体系优化新.ppt

什么是Ct值和Δ Rn？ 为什么用Ct值定量而不用终点相对荧光强度定量 实时荧光PCR是如何定量？ 实时荧光定量PCR优化目标 优化内容 引物设计和筛选 探针设计和筛选 反应体系的优化 反应程序的优化 二级结构分析 引物筛选结果 引物用量的优化 探针设计和 筛选1 探针的Tm值 探针用量的优化 不同Taq E的比较 Taq E浓度的优化 dNTP浓度的优化 Mg2+对荧光强度的影响 Mg2+和退火温度的优化 --------(方阵法） PCR促进剂的影响 AMV与M-MLV的比较 M-MLV的用量的优化 逆转录时间的比较 优化前后的比较 多色荧光PCR 双色荧光PCR 三色荧光PCR 多色荧光PCR 多色荧光PCR的特点 双色荧光PCR 三色荧光PCR 多色荧光PCR应注意的几个问题 ①高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检测多种病原体. ②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细菌战剂的同时侦检. ③经济性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息.? 不加内标（单色PCR) 加人内标 (双色PCR） FAM JOE * 荧光PCR体系的优化及多色荧光PCR 程扬健 厦门大学生命科学院分子诊断实验室 认识它们吗？！ Ct值中的C代表循环数（Cycle），t代表域值（threshold），Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 Δ Rn: 相对荧光强度 Ct (S/B) 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（如图所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 在一定范围: Ct值∝ 1 lg C PCR检测过程 样 品 处 理 PCR 扩 增 结 果 检 测 Real time PCR 1、Ct值 2、ΔRn值 3、R值 HCV 分子信标 引物的设计与筛选1 序列查找与比对 附：主要数据库的网址 www.ccdc.cam.ac.uk Cambridge Crystallographic Data Center CSD Research collaboratory for Structural bioinformatics PDB www.prf.or.jp Protein Research Foundation, Japan PRF National Biomedical Research Foundation PIR www.expasy.ch Swiss Institutes of Bioinformatics SWISS-PROT www.ddbj.nig.ac.jp National Institute of Genetics, Japan DDBJ www.ebi.ac.uk European Bioinformatics Institute EMBL National Center for Biotechnology Information GenBank National Library of Medicine MEDLINE 网址 组织 数据库 条件： 42℃；50mM Na+; 2.5mM Mg2+ /~zukerm/rna/ 引物的设计与筛选2 HCV 5’ UTR 引物设计 5’ 3’ HCV 引物的设计与筛选3 1 2 3 4 5 引物的设计与筛选4 不对称PCR（S/A=1：4）Vs 对称PCR（S/A=1：1） 引物的设计与筛选5 探针设计 探针设计和 筛选2 ＋ 探针设计和 筛选3 退火温度的确定 0.6uM 0.3uM 0.15uM 探针设计和 筛选4 Taq 1 Taq 2 反应体系的优化1 0.5 U/T 1.0 U/T 2.0 U/T 3.0 U/T 反应体系的优化2 20uM/T 10uM/T 40uM/T 80uM/T 反应体系的优化3 M-MLV AMV Well Ct F1 27.373 F2 30.291 F5 26.144 F6 29.143 G1 26.205 G2 29.896 G5 26.221 G6 29.661 H2 26.279 H3 29.854 H4 0.000 10u/test 20u/test 30u/test 40u/test 50u/test NTC F6 F5 高