[医药卫生]核酸分子杂交技术张华屏.ppt

核酸分子杂交技术 简要概述 核酸分子杂交是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补配对原则形成双链的过程。杂交的双方分别称为探针与待测核酸, 杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。 核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价健的形成即出现稳定的双链区，这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间。 核酸分子杂交技术是目前生命科学研究领域中应用最广泛的技术之一,是定性或定量检测特异DNA或RNA序列片段的有力工具． 在基因工程技术中，用放射性标记或非放射性标记的探针进行菌落杂交，可以从cDNA文库或基因组文库中筛选出特定的克隆，获得某一重组体；用克隆化的DNA片段做探针杂交，可以确定基因组DNA上特定区域的核苷酸同源序列或对某一已知基因进行染色体定位．另外，用于遗传疾病的基因诊断，限制性片段长度多态性疾病的相关分析，基因连锁分析，法医学上的性别分析和亲子鉴定等． 主要内容 分子印迹（渍）技术 固相支持物（硝酸纤维素虑膜和尼龙膜）的特点 分子印迹（渍）的分类 分子杂交技术 核酸分子杂交 的原理 探针（probe) 探针的分类 探针的制备 　Southern杂交技术 重点内容 分子印迹（渍）的分类 DNA的变性和复性 放射性标记探针的制备方法 Southern杂交的基本步骤 印迹（渍）技术 Southern Blot Northern Blot Western Blot Eastern Blot Dot Blot In situ hybridization 分子杂交技术Hybridization technique DNA变性 方法 热变性：90~100℃ 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶解温度(melting temperature,Tm) DNA复性或杂交(hybridization) DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等 双链DNA进行加热变性，当温度升高到一定高度时，DNA溶液在260nm处的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度继续升高，吸光度也不再明显变化。若以温度对DNA溶液的紫外吸光率作图，得到的典型DNA变性曲线（S型）。 DNA的复性(renaturation) 变性的DNA在适当条件下，两条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程也称为退火(Annealing)。 DNA的复性的影响因素： 1、温度和时间： 一般认为比Tm 低5℃左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4℃以下)，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性(单链)状态。 这说明降温时间太短以及温差大均不利于复性。 2、DNA浓度：溶液中DNA分子越多，相互碰撞结合的机会越大，有利于复性。 3、DNA顺序的复杂性： 简单顺序的DNA分子，如多聚(A)和多聚(U)这二种单链序列复性时，互补碱基的配对较易实现。而顺序复杂的序列要实现互补，则困难得多。 探针标记物应具备的条件 高度灵敏性 标记物与探针的结合不影响碱基配对的特异性 不影响探针分子的主要理化特性 （Tm值等） 用酶促方法进行标记时酶的活性应不受影响 检测应具有特异性 放射性标记 缺口平移法(nick translation) 随机引物法 DNA快速末端标记 聚合酶链式反应法 化学标记技术：直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上 标记物 放射性同位素 灵敏度极高，可以检测10-14~10-18 g 的物质。最适条件下，可以测出样品中少于1000个分子的核酸含量。 放射性核素与相应的元素具有完全相同的化学性质，对酶促反应无任何影响，不会影响碱基配对的特异性、稳定性和杂交性质。 特异性高，假阳性结果很少是由于放射性核素引起的。 缺点： 放射性污染。 过强的放射线可以造成核酸分子结构的破坏。 半衰期短，标记后立即使用（32P/14.3d，35S/87.1d，3H/12.1y ）。 Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 预杂交（封闭） 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测 Northern 印迹杂