[医药卫生]质粒大提.ppt

基因工程（genetic engineering ） 三、基因工程实验特点及要求 1. 微量操作 2. 连续性操作 3. 低温操作 4. 防止污染（杂质污染、细菌污染） 5. 实验物品切忌乱扔乱丢 6. 认真写好实验纪录 第一次实验: 质粒DNA大量制备、纯化及鉴定 第二次实验： RT-PCR（目的基因的制备）; DNA限制性内切酶消化 第三次实验： 电泳、片段回收及重组连接;感受态细菌制备、重组质粒的转化 第四次实验重组质粒的鉴定（小量快速制备、酶切电泳）,考试 载体的定义 碱裂解法 纯化 — LiCl 沉淀 、RNase 及酚抽提 LiCl 沉淀: 强脱水剂，使大分子的蛋白质和 RNA沉淀，从而除之。 注意：预冷，应注意试剂是否清亮，否则为变质 DNA片段的琼脂糖凝胶电泳 四、操作步骤： 关键操作：点样 在加样孔正上方，不要进入孔中 加样器一旦按下，就一定保持按住直至加样器离开加样孔，否则会将样品又吸回到tip中，使加样失败 一、原理 分离原理：电荷效应、分子筛效应 显色原理： 溴化乙锭（EB）： 本身在紫外光照射下能发出橘红色荧光，当其与DNA分子结合后，荧光强度大大增强，与DNA含量成正比。但本身是强烈的致癌物。 Gold view：和双链DNA分子结合，在紫外光激发下，发出绿色荧光。 二、影响DNA电泳的因素 DNA分子的大小、形态 迁移率：超螺旋＞线性＞开环 三、电泳分子量标记物与点样液 电泳分子量标记物又称marker，为已知片段长度的DNA片段所组成，用于估算未知DNA片段的大小。如我们所用的λDNA/HindⅢ的marker，由七条已知片段大小的DNA片段所组成，依次是23.7、9.46、6.75、4.26、2.26、1.98、0.58（kb）。 线性DNA比较 * * 分子生物学实验 基因工程是在分子水平上，用人工方法提取或制备DNA，在体外切割、拼接和重新组合，然后通过载体把重组的DNA分子导入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达，生产出人们所需要的产物，或定向创造生物新性状，并使之稳定地传给下一代。 基因工程：称重组DNA工艺学。 目的 ： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA序列 ② 获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质) 基因工程的基本过程 分 切 接 转 筛 表 载体是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA。这种DNA进入受体细胞后，可自主复制，或插入到基因组中，随受体细胞的基因组一起复制。载体上还带有特定的药物抗性基因，便于筛选。 原理 实验步骤 1. 收集细菌：50ml 细菌，离心 3000rpm, 10min 2. 弃上清 3. 加 2ml solution I (预冷), 悬浮好, 即用加样器吹打 原理 葡萄糖：增加粘度，防止DNA受机械作用而断裂 Tris：缓冲作用，稳定pH EDTA： 鳌合金属离子，抑制DNase，防止DNA降解 4. 加4 ml solution II, 缓慢轻柔颠倒多次，观察菌液变清亮，有粘稠物出现，冰浴3~5min（要少于5min）。 SDS： 是离子型表面活性剂，去污剂，溶解细胞膜上的 脂类，破膜 解聚核蛋白 与蛋白质，K+和膜形成复合物 NaOH（pH12.6）：使核酸变性 注意：此试剂现配现用，冬季应注意是否有结晶，否则加热使之融化，溶液变清澈 5. 加 3ml solution III (预冷), 轻柔颠倒数次后， 震摇数次（用手），应使白色沉淀散开，冰浴 10~15min 取上清 原理： KAc： pH4.8：中和复性，使质粒DNA复性，但染色体由于分子量大，复性所需时间长，所以在10min左右内质粒复性，为可溶状态，而染色体则为沉淀。 K＋与SDS、蛋白质和膜形成溶解度小的复合物 Solution I: 2ml Solution II : 4ml Solution III: 3ml 通过变性与复性之差去除染色体 Solution I: Solution II :Solution III＝1：2：1.5 6. 加0.6体积（约5.4 ml）的异丙醇，室温放置5～10min（可延长）； 3000 rpm，离心5 ~10min； 弃上清，保持倒立位置，用吸水纸吸净（一定将异丙醇除净） 加入TE 3ml，用加样器吹打几次使沉淀彻底溶解 异丙醇作用原理 蛋白质为胶体，异丙醇可去除其水化膜，使之沉淀，可去除试剂中的各种盐分 优点：加入量小， 室温，时间短， 缺点：不挥发 纯化 7 . 加入 3 ml LiCl （预冷），混匀，冰浴5～10 min 离心，2500 rpm，5～10 min 转移上清