[基础医学]免疫组织化学技术.ppt

免疫组织化学技术 免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测的技术。 基本原理 抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 免疫组化的特点 特异性强 敏感性高 定位准确、形态与功能相结合 免疫组化的作用 　凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫组织化学方法显示 。 实验所用标本 实验设备 恒温冰冻切片机、脱水机、石蜡包埋机、切片机、摊片机、烤片机、冰箱、电磁炉、高压锅、染色架以及离心机和免疫组化试剂等 免疫组化技术分类 1、免疫荧光方法 2、免疫酶标方法 3、免疫胶体金技术 4、免疫铁蛋白法 5、放射免疫自显影法 免疫组化操作步骤 一.石蜡切片制作 1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12h 2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1天，80%酒精过夜，95%酒精3h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2h 3、透明：1:1无水酒精二甲苯45min，二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）各30min 4、包埋：（恒温箱内进行）浸入石蜡，1:1二甲苯石蜡（58℃）45min，石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）共2.5h，用石蜡（Ⅲ）包埋组织 5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7μm，的石蜡带 6、贴片：将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上 （洗片：1%HCl浸泡过夜、蒸馏水冲洗、95%酒精浸泡2h后擦干 → 涂胶：防脱剂多聚赖氨酸） 7、烤片：68℃恒温箱内烤片2h 二.SP（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结）三步法染色步骤 1、脱蜡、水化 60℃×20分钟→二甲苯2 × 10分钟 100%的绝对乙醇:2×5分钟; 95% ethanol 2 minutes；95%的乙醇2分钟 80% ethanol 2 minutes； 70% ethanol 2 minutes； distilled water:5 min；蒸馏水:5分钟 PBS洗3次×3 min。 2、阻断：3%H2O2去离子水（或80%甲醇）孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性 3、PBS冲洗2-3次，每次5min 4、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温 5、PBS冲洗2-3次，每次5min 6、封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20min，甩去多余液体 7、滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1h，或者37℃1h，或者4℃过夜（需在37℃复温45min） 8、PBS冲洗2-3次，每次5min 9、滴加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗40～50μl，室温静置1h，或37℃1h 10、PBS冲洗2-3次，每次5min 11、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30min-1h 12、PBS冲洗2-3次，每次5min 13、显色：DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细胞） （显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀） （A：DAB B：H2O2 C：磷酸缓冲液） 14、自来水冲洗10分钟终止反应 15、复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化 16、自来水冲洗10-15min 17、常规脱水 50% ethanol 1-2 min， 70% ethanol 1-2 min 95% ethanol 1-2 min； 95% ethanol 1-2 min； 100% absolute ethanol: (1-2) min。 透明：Xylene 1×(1-2) min→Xylene 2×(1-2) min 封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检 三.二步法免疫组化染色步骤 二甲苯脱蜡，梯度酒精置