[理化生]第一单元 蛋白质化学-1.ppt

* * 可用电泳来分离氨基酸 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1?10-9mol。 末端基氨基酸测定 丹磺酰氯法(DNS) 氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。 末端基氨基酸测定 氨肽酶(amino peptidases)法 此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。 末端基氨基酸测定 肼解法 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。 末端基氨基酸测定 羧肽酶(carboxypeptidase)法 3.3 二硫桥的断裂 断裂二硫桥的主要方法是过甲酸氧化法和巯基化合物还原法。 s s HCOOOH SO3H SO3H 3.4 氨基酸组成的分析 用于蛋白的氨基酸组成测定的水解方法主要是酸水解，同时辅以碱水解。 氨基酸分析仪图谱 方法： 6MHcl 优点： 不引起消旋，能得到L-氨基酸（17种） 缺点： Trp侧链的吲哚基团被破坏；Asn，Gln的酰胺基团被水解，变成Asp，Glu 酸水解： 方法： 5MNaOH 优点： Trp 缺点： 多数氨基酸会不同程度的破坏，产生消旋。 碱水解： 3.5 多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化 1)酶裂解法 胰蛋白酶(trypsin) 这是最常用的蛋白水解酶，专一性强，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。得到的是以Arg或Lys为C-末端残基的肽段，肽段数目等于多肽链中Arg和Lys总数加1。 为了减少胰蛋白酶的作用位点，可以通过化学修饰将其侧链基因保护起来。用马来酸酐可以保护Lys残基侧链上的ε－NH2，胰蛋白酶就不会水解Lys竣基参与形成的肽键，只能断裂Arg羧基所形成的肽键；反之，如果用1，2－环己二酮修饰Arg的胍基，则胰蛋白面只能裂解Lys羧基所形成的肽键。 如果想增加多肽链中胰蛋白酶的断裂点，可以用丫丙啶处理多肽链样品，这时Cys残基侧链被修饰成类似Lys的侧链，也具有ε－NH2。这样胰蛋白酶便能断裂Cys羧基端的肽键。 R1=Lys和Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro 水解受抑。 糜蛋白酶(chymotrypin)或胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)：它断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸的羧基参与形成的肽键。断裂键邻近的基团是碱性的，裂解能力增加；是酸性的，裂解能力将减弱。 肽链 水解位点 R1=Phe, Trp,Tyr时水解快; R1= Leu，Met和His水解稍慢。 R2=Pro 水解受抑。 肽链 水解位点 胃蛋白酶(pepsin) 它要求被断裂键两侧的残基都是疏水性氨基酸，如Phe-Phe。此外与糜蛋白酶不同的是酶作用的最适pH，前者是pH2，后者是pH8-9，由于二硫键在酸性条件下稳定，因此确定二硫键位置时，常用胃蛋白酶来水解。 R1和R2＝Phe, Trp, Tyr; Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。 消化道内几种蛋白酶的专一性 （Phe.Tyr.Trp） （Arg.Lys） （脂肪族） 胰凝乳蛋白酶 胃蛋白酶 弹性蛋白酶 羧肽酶 胰蛋白酶 氨肽酶 羧肽酶 （Phe. Trp） 2)化学裂解法 溴化氰只断裂由Met残基的羧基参加形成的肽键。 1)Edman化学降解 3.6 肽段氨基酸序列的测定 2)酶降解法 蛋白水解酶中有一类是肽链外切酶或称外肽酶（exopeptidases)，例如氨肽酶和羧肽酶，它们分别从肽链的N端和C端逐个地向里切。因此，原则上只要能跟随酶水解的过程分别定量测出释放的氨基酸，便能确定肽的顺序。然而这种方法实际上有许多困难，局限性很大，它只能用来测定末端附近很少几个残基的顺序。 3)质谱法 质谱法一次能测的氨基酸残基一般10个左右，但质谱法具有样品用量少，分析速度快的优点。 3.7