[理学]3-2基因工程的主要技术与原理-分子杂交技术.ppt

三、Southern blot hybridization 杂交：在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸 探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同 源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而 吸在滤膜上。 * * 基 因 工 程 淮阴师范学院 杨文杰 生物技术专业核心课程 E 基因的化学合成 C 分子杂交技术 A 核酸的分离和纯化 B 核酸电泳 3. 基因工程的主要技术及原理 F PCR技术 D DNA核苷酸序列分析 第三节 分子杂交技术 (molecular hybridization technique) 分子杂交:是分子克隆中的一类核酸和蛋白质 分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子 或蛋白质分子是否存在，以及其分子量的大小。 根据其检测对象的不同可分为Southern杂交、Northern杂交和Western杂交，以及由此而简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交等。 一、基本原理 带有互补核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们 混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成 双链的结构，形成杂种核酸分子。 能形成杂种分子的不同DNA或RNA分子，其亲缘关系较为密切，反之其亲缘关系则比较疏远。 当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交, 便可查明该样品中是否存在与该标记核酸分 子具有同源性的核酸分子。这个标记的核酸 分子称为探针(probe)，可以是DNA，也可以 是RNA，或合成的寡核苷酸。 1、核酸印迹（Nucleic acid blotting): 将核酸样品（DNA、RNA或蛋白质）在凝胶 上分离，然后将样品通过影印的方式转移到固 相支持物如滤膜上。 二、基本过程 2、核酸杂交（Hybridization): 将已印迹有核酸样品的滤膜同带有放射性标 记或其它标记的DNA或RNA探针(Probe)进行杂交。 3、结果检测（Detection Results): 通过放射自显影或显色反应，判断样品中是 否有与探针同源的核酸分子或与抗体反应的蛋白 质分子。 核酸印迹的方式： 电泳凝胶核酸印迹法(Southern/Northern blot) 斑点印迹法(Dot blot) 菌落或噬菌斑印迹法(Colony/Plaque blot) 1、原理： 通过毛细管作用、电转移、真空转膜等方法，使在凝胶电泳中已分离的DNA片段转移并结合到适当的滤膜上，然后通过同已标记的单链DNA或RNA探针进行杂交，以检测被转移DNA片段，称为DNA印迹杂交技术。 在1975年，由英国的E. Southern首先设计发明的， 因此又称为Southern杂交（Southern blotting)。 2、特点： 作用对象：DNA分子 DNA片段需经凝胶电泳分离 固相支持物：可选用的滤膜种类较多 灵敏度高 3、基本过程： DNA的片段化及其电泳分离 凝胶电泳后的变性处理 转移并固定到滤膜上 杂交 检测与分析 The Southern blotting technique 1）DNA的片段化及其电泳分离 2）凝胶电泳后的变性处理 在0.4N NaOH碱性条件下变性，使 双链DNA分子变成单链。 再在1.5M NaCl/1M Tris（pH7.4） 条件下中和使DNA仍保持单链状态。 凝胶 3）转移并固定到滤膜上 通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝 胶上的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。最后 通过80℃处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上。 Southern blotting 装置示意图 4）探针的制备及杂交 预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预 杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜 本身对探针的吸附。 探针 标记与目的序列同源的核苷酸片段作为探针； 65?C杂交12-16hr ?洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。 安装杂交管 杂交炉 5）检测与分析 通过放射自显影或生化检测， 就可判断滤膜上是否存在与探针 同源的DNA分子及其分子量。 Southern杂交主要用来判断某 一生物样品中是否存在某一基因， 以及该基因所在的限制性酶切片 段的大小。（DNA水平） Southern杂交也可检测目的基 因的拷贝数。 1 2 3 4 5 CK Southern bloting 1、原理： 根据毛细管作用的原理，使在凝胶电泳中已分 离的RNA转移并结合到适当的滤膜上，然后通过 同已标记的单链DNA或RNA探针进行杂交，以检测 被转移RNA片段，称为RNA印迹杂交技术。 在1979年，由J. C. Alwine等人设计。也称 为Northern杂交（Northern