[理学]3st第三章-核酸操作提取与电泳.pdf

第三章 核 酸 操 作 的 基 本 技术 本章主要讲授内容： 本章主要讲授内容： 核酸的提取与纯化 核酸的提取与纯化 核酸的检测 核酸的检测 第三章 核酸操作的基本技术 • 核酸的操作技术是基因工程最基本的技 术之一。在基因工程技术中 ,研究的对 象和材料都涉及核酸。 • 核酸操作基本技术包括核酸的提取与纯 化、检测与保存、凝胶电泳、分子杂交 等。 第三章 核 酸 操 作 的 基 本 技术 • 第一节 DNA的提取与纯化 • 第二节 RNA的提取 • 第三节 核酸的检测 第一节 DNA的提取与纯化 • 一般原则： 尽量保持核酸的完整性 , 即保持天然状态。 防止核酸酶对核酸的降解 要防止化学因素 ( 酸、碱等 ) 和物理因素 ( 高 温、机械剪切等 ) 引起核酸变性或破坏 第一节 DNA的提取与纯化 • 细胞中DNA常与RNA，蛋白质结合成复合体 • DNA提取，纯化的基本步骤： a 破坏细胞壁，细胞膜，释放出可溶性DNA分 子 b 变性，分解PRO：使DNA和蛋白质的复合体 解离 c 将DNA从其它大分子中分离 一 质粒DNA的提取 质粒所在细胞的结构特征： 细胞壁，膜，RNA，蛋白质等 坚韧细胞壁 溶菌酶,EDTA,SDS RNA,蛋白质 Pr酶,Rnase,有机溶剂 染色体 变性复性条件不同 DNA？ 一 质粒DNA的提取 质粒DNA（核内DNA）提取 需最大限度减少染色体 DNA的污染。分离它们的原理是超螺旋DNA与线性 DNA 变性，复性的条件不同 高PH时，均变性，但质粒DNA 由于分子量小，复性 速度快，而染色体DNA大部分还保持单链形式的变 性状态。然后可用盐类的选择性沉淀将质粒DNA和 染色体DNA区分开 一 质粒DNA 的提取 1 主要提取试剂的作用 • 溶菌酶：溶解菌体细胞壁的β-1，4糖苷键，即具 溶菌作用。 葡萄糖： 增加溶液粘度，防止DNA受机械切力作 用而降解 • 一 质粒DNA 的提取 1 主要提取试剂的作用 EDTA：金属离子螯合剂，抑制脱氧核糖核酸酶（Dnase)对 DNA的降解作用 SDS： 阴离子表面活性剂， ①可破坏细胞膜，使DNA释放出来， ②结合蛋白质，使蛋白质沉淀下来 ③抑制脱氧核糖核酸酶（RNase)的活性 • 一 质粒DNA 的提取 1 主要提取试剂的作用 酚、氯仿：蛋白质变性剂。使蛋白质失水变性，离心后与水相 （含DNA）分离 异戊醇： ①降低分子表面张力，可减少气泡的产生 ②有助于分相， 无水乙醇：DNA的沉淀剂。夺去DNA周围的水分，使DNA失 水而易于聚合 一 质粒DNA 的提取 1 主要提取试剂的作用 NaOH：核酸在pH5-9的溶液中稳定, 12 pH 或 pH3时会引起氢键断裂 KAC： ，KAC –HAC pH为4.8缓冲液，变性的质粒 DNA在此溶液中发生复性 质粒DNA提取一般操作步骤 （碱解法） 溶菌酶，EDTA，葡萄糖 收集菌体 壁膜破，内容物释放 液 液