[理学]PCR引物设计.pdf

PCR 引物设计 kechr@ PCR 的基本原理 • PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点 1 2 3 高温变性 低温退火 适温延伸 重复1~3步 25~30轮 成 形 94 度 温 D N 目的DNA片段 72 2 A 链 单 条 性 变 扩增100万倍以上 （℃） 子链延伸 55 DNA加倍 DNA单链 与引物复性 22 DNA双螺旋 1 2 3 4 5 时间（min） 什么是引物 引物是一段寡聚核苷酸序列 引物的种类 1、PCR引物 2、测序引物 3、杂交探针 4、简并引物 5、其他引物 引物的作用（基因获得、测序、检测等） 引物设计与分析软件 引物设计软件（ Primer 、 Oligo 、 codehop、FastPCR、Generunner 、 Vector NTISuit、Dnasis、Omiga、 Dnastar等） 引物分析软件（ Oligo 、 Primer、Blast、 等） 引物设计的需考虑的问题 引物长度（primer length） 产物长度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) ΔG值(internal stability) 引物本身和引物之间二聚体及发夹结构 （duplex formation and hairpin） 错误引发位点（false priming site ） 引物及产物GC含量（composition） PCR 引物设计原则 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上有哪些信誉好的足球投注网站 不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对 （Alignment ），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为 过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃ GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50% 寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按 公式Tm= 4 （G+C）+2 （A+T ）