[理学]三、DNA与RNA分析方法.ppt

第三章 DNA与RNA分析方法—电泳 电泳是分离、鉴定和纯化DNA与RNA片段的标准方法，该方法操作简便、快速，可分辨其他方法(如密度梯度离心、纤维素柱等分离方法)无法分离的DNA或RNA片段。将低浓度的荧光 嵌入染料染色后可直接确定DNA或RNA在凝胶 中的位置。检测的量可少至1-10ng。并可从凝胶中回收DNA条带，用于基因的克隆等操作。 根据凝胶介质的不同可分为琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。 第一节 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海藻中提取出来的线状高聚物，经过纯化后可作为分离DNA或RNA的介质。琼脂糖经某些化学修饰后可变为低熔点琼脂糖，其熔点和凝固点降低，但凝固后凝胶的强度无明显改变。琼脂糖的基本结构： 琼脂糖凝胶分离DNA片段的原理 琼脂糖吸水形成胶球，不同大小的DNA分子通过胶球之间的孔隙时移动的速度不同，DNA分子越小移动的速度越快，DNA分子越大移动的速度越慢。 一、普通琼脂糖凝胶电泳 目的：检测、分离和纯化DNA或RNA片段（0.5-25 kb） 1. 凝胶浓度与待分离DNA大小的关系 琼脂糖浓度（%） 线性DNA的有效分离范围（kb） 0.5 30 - 1 0.7 12 - 0.8 1.0 10 - 0.5 1.2 7 - 0.4 1.5 3 - 0.2 2.0 2 - 0.1 2. 琼脂糖凝胶的制备 1) 配胶：按一定的比例加入琼脂糖和电泳缓冲液 常见的电泳缓冲液。 缓冲液 使用浓度 储存液 TAE ( pH 7.5 – 8.0） 1 x : 40 mM Tris-乙酸 50 x : 242 g Tris 1 mM EDTA 57.1 g 冰乙酸 100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0) TPE (pH 7.5 – 8.0) 1 x : 90 mM Tris-磷酸 10 x : 108 g Tris 碱 2 mM EDTA 15.5 ml 85% 磷酸 40 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0) TBE (pH 8.3) 0.5 x : 45 mM Tris-硼酸 5 x : 54 g Tris 碱 1 mM EDTA 27.5 g 硼酸 20 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0) 2）煮胶： * 注意要使琼脂糖充分胶化 3）倒胶： *