[理学]二、DNA和RNA的制备.ppt

第二章 DNA与RNA的制备 第一节 DNA的制备 DNA是生物的主要遗传物质，因而DNA的制备是基因工程的基础。由于生物形式的多样性（细菌、植物、动物），以及DNA在生物体中存在形式的差异（染色体、线性DNA、质粒），因此，制备DNA的过程和方法也不相同。 一、DNA在生物体中的存在形式 1．染色体DNA：生物体遗传信息的主要载体 * 原核生物染色体：结构简单，储存的信息相对较少 * 真核生物染色体：结构复杂，储存大量的遗传信息 用途：分离目的基因，研究基因的调控与表达 2．病毒和噬菌体DNA 构建克隆载体，分离目的基因 3．质粒(Plasmid)DNA（染色体外遗传物质） 特点：能自我复制，大小不一，在体内以超螺旋形 式存在，在体外以超螺旋、开环和线形存在。 用途：构建克隆载体，分离目的基因 4．叶绿体和线粒体DNA 构建克隆载体，分离目的基因 二、天然DNA的提取 1.准备生物材料： 选取的材料－－提取DNA得率最高的生长期，或是DNA容易提取或含量高的组织 细菌－－对数生长期后期 植物－－幼嫩组织、暗培养1－2天 肝脏－－清除胆囊（含高活性的酶） 2.裂解细胞: 原核生物－－溶菌酶，NaOH/SDS，煮沸，冰冻，超声波 动、植物 －－粉碎 3.分离和抽提DNA: 1）提取总DNA 加蛋白质变性剂 2）提取叶绿体或线粒体等细胞器的DNA、病毒和噬菌体DNA： 先需要分离出完整的细胞器、病毒和噬菌体，提取DNA之前还需DNase处理，水解其它的DNA 3） 提取质粒DNA：使其与染色体DNA分开 (一)、细菌总DNA的制备(Escherichia coli) 1.菌体培养: 将活化的菌体接种于LB(Luria- Bertani) 培养基，于37oC培养至对数生长期,然后置冰水浴20min 2.收集菌体: 离心(5000g, 5 min) (50ml) 3.菌体裂解: 加5ml冷 TES (0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA，0.15M NaCl,pH8.0)加10 mg 溶菌酶,于37oC温 育10min 4. 去RNA: 加入1 mg RNase于50oC温育15 min 5. 去蛋白: 加入0.6 ml、10% SDS和Protease K(0.1 mg/ml)，60 oC、30min；加苯酚-氯仿抽提(等体积) 6. 沉淀DNA: 加入1/10 V 的NaAc，2 V 无水乙醇；以玻璃 棒缠绕絮状沉淀，溶于TE Buffer中 (二)、细菌质粒DNA的制备 常用的碱法、煮沸法、SDS等均可； 选择何种方法制备质粒DNA，视不同的菌株和不同大小的质粒DNA分子以及以后进行的不同实验等具体情况而定： ? 菌株类型：如大量提取HB101、TG1菌株中的质粒，不宜用煮沸法； ? 质粒的大小：大于15kb的质粒DNA易被强烈的物理或化学作用破坏，所以常选用操作过程较温和的SDS法，细菌悬浮液中含有10%的蔗糖以提高溶液的渗透压，减轻细菌裂解时DNA泄漏过快产生的机械剪切力。 ? 细菌染色体DNA变性条件强弱的控制：碱法是最常用的质粒DNA提取方法，它对细菌的裂解，细菌染色体DNA及蛋白质变性充分，所以提取的质粒DNA产量高、纯度好。 碱裂解变性法： 1. 菌体培养：将活化的菌体接种于含一定浓度 抗生素的LB培养基中，于37?C培养至对数生 长期后期，然后置冰水浴20 min。 1) 常用的抗生素及其使用浓度 氨苄青霉素：（Ampericillin, Ap） 50-150 μg/ml 链霉素： （Streptamycin, Sm） 25-50 μg/ml 四环素： （Tetracycline, Tc） 10-50μg/ml 氯霉素： （Chlorampenicol, Cm）20-170 μg/ml 卡那霉素： （Kanamycin, Km） 25-50 μg/ml 2) 常用的质粒载体及其起始复制序列（复制子） 质粒 起始复制序列 拷贝数 pBR322 pMB1 15-20