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PCR原理 SYBR Green I 工作原理 SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光 定量与常规PCR的差别 常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终产物进行定量及定性分析 如何定量？ Ct值的概念 Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。 定量原理 起点定量与终点定量 DNA测序 基因测序作为精准医疗的重要一环，随着技术的进步及成本的下降，近年来发展迅速，从2007年7.94亿美元增长到2013年45亿美元，预计到2018年将达到117亿美元。 基因测序应用市场空间广阔，我国主要分为四个方向：遗传病诊断、产前筛查与诊断、植入前胚胎遗传学诊断、肿瘤诊断与治疗。 双脱氧法测序原理： DNA链中的核苷酸是以3′，5′-磷酸二酯键相连接，合成DNA所用的底物是2′-脱氧核苷三磷酸（dNTP），在Sanger 双脱氧链终止法中被掺入了2′，3′-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),当ddNTP位于链延伸末端时, 由于它没有3′-OH，不能再与其它的脱氧核苷酸形成3′,5′-磷酸二酯键，DNA合成便在此处终止，如果此处掺入的是一个ddATP，则新生链的末端就是A，依次类推可以通过掺入ddTTP、ddCTP、ddGTP ，则新生链的末端为T、C或G。 自动化测序 Sanger测序仍是目前基因分型的金标准。相对于其他分型技术具有最高的准确性，并能检测新的突变 优点：结果可靠、准确 缺点：成本高、速度慢 绘制第一张人类基因组图谱共耗费4亿多美元和13年时间 焦磷酸测序技术 1、反应体系：由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。 反应底物有脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）、5’腺苷-磷酰硫酸（APS）、荧光素。 4种酶：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷腺苷双磷酸酶（Apyrase） 2、反应过程： 在每一轮测序反应中，反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）。若刚好能和DNA模板上的碱基配对，在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端发生聚合反应，同时释放一分子的焦磷酸。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的焦磷酸与APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。 通过微弱光检测装置及处理软件可获得一个特异的检测峰。若加入的dNTP不能和DNA模板上的碱基配对，则无检测峰。根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。 第二代测序技术由于测序仪设备较昂贵，很难普及到一般的实验室 第三代测序技术的目标是实现人全基因组3分钟的测序时间及5000美元的测序价格 DNA芯片 DNA芯片是将大量已知序列的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有序地、高密度地排列固定于支持物上，然后与标记的样品根据碱基配对的原则进行杂交，通过检测分析杂交信号的强度及分布，对基因序列及功能进行大规模、高通量的研究。 DNA芯片技术的主要步骤： 芯片的制备 样品的制备 杂交反应 信号检测及结果分析 DNA芯片制备 分为原位合成（在片合成）和直接点样（离片合成）两大类 1、原位合成：是指直接在芯片上用四种核苷酸合成所需探针的DNA芯片制备技术。 光导原位合成法：是将半导体工业的光蚀刻技术和DNA合成技术结合起来，利用光保护基团修饰芯片片基表面碱基单体的活性羟基，通过设计特定的光刻掩膜和不断地更换曝光区域，使基片上受光保护部位的羟基脱保护而活化，加入核苷酸底物后，直接在片基上合成寡聚核苷酸探针。 原位光刻合成基因芯片原理 探针合成 直接点样：是指将预先合成好的寡核苷酸、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机直接点在芯片片基上，并通过理化方法使之固定。 多用于大片段DNA探针的芯片制备 样品的制备 样品的制备过程包括核酸分子的纯化、扩增和标记。生物样品多为复杂的生物分子混合体，一般不能直接用于芯片反应，同时由于生物样品本身所含靶分子的量较少，往往在标记和分析前需要对样品进行提取、扩增，然后再进行标记、检测。 目前样品的标记主要采用荧光标记法。 可以使用荧光标记的引物或荧光标记的三磷酸脱氧核糖核苷酸对样品进行标记。 常用的荧光物质有异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明（RB200）、羟基荧光素（FAM）、Cy3、Cy5等。 杂交及结果分析 1、杂交反应：在DNA芯片技术中的杂交反应与传统的杂交方式类似，属固-液相杂交范畴。杂交条件要根据芯片中DNA片段的长短、类型和芯片本身的用途来选择。 如要检测表达情况，杂交时需要高盐浓度、低温和长时间。 2、结果分析