[2018年必威体育精装版整理](执论)管碟法测定抗生素效价中的影响分析及对策.doc

管碟法测定抗生素效价中的影响分析及对策 内江山山制药有限公司 邱敏 目的 提高管碟法测定抗生素效价的准确性。 方法 按操作步骤逐步分析，并提出合理的解决方案要。 结果 减少外界因素与人为因素给试验带来的误差。 结论 可以提高测定结果的准确性。 管碟法是国内外常用的抗生素微生物检定法[1]，利用管碟法测定抗生素效价，具有准确、直观、重复性好等优点，因而被广泛采用。但是整个试验过程中影响结果的因素很多，任何一个环节操作不当或者忽略就会造成很大误差，导致整组试验失败。根据实际操作中的积累经验，对管碟法中影响试验结果的因素进行如下分析及提出解决的方法。 1. 实验器材的准备 1.1 实验器材的选择 试验应该选择底面平整的玻璃双碟，避免底面的凹凸影响琼脂层的厚度。可将双碟放置在水平台上，下垫一层白纸，加入3mL水，再滴加蓝墨水，根据蓝色是否深浅一致来判断双碟底面平整程度。小钢管则应该选择加工精细的同一批产品，这样才能保证管壁厚薄与重量均匀一致，使得小钢管在培养基中下陷相同的深度，抗生素溶液扩散均匀有可比性。如果小钢管两端不够平，就应 予以剔除，否则会使抗生素溶液漏出，破坏均匀扩散现象。 1.2 实验器材的清洗 抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素（庆大霉素、争光霉素、链霉素等）或者被清洗用的杀菌剂（如新洁而灭、洗洁精、去污粉等）污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。 160℃干热灭菌2h后备用。 2. 配制试验所需的样品、标准品、缓冲液与培养基 2.1 样品与标准品溶液的配制 标准品与样品从冰箱取出后，使与室温平衡。供试品应放于干燥器内至少30min方可称取。称量最好为一次取样称量，动作迅速，不得反复称取，取样后立即将称量瓶瓶盖盖好，以免吸水。标准品的称量最好用1/100,000克的分析天平，样品称量不得低于1/10,000克的分析天平。天平中的干燥剂应保持经常注意更换。称量结束后，加入超声波处理后的磷酸缓冲液，定容至刻度，过滤并稀释。稀释时，都应采用容量瓶，每一步稀释取样量不得少于2mL。用刻度吸管吸取溶液前，要用待稀释液冲洗吸管2～3次，吸取溶液后，要用滤纸把刻度吸管外壁多余液体擦去，再从起始刻度开始放溶液。把稀释后的抗生素溶液分装至干燥灭菌试管待用。在称量抗生素样品过程中，操作者的工作服上有可能会沾染抗生素粉末，在配培养基、加底层培养基、加菌层培养基或滴加抗生素溶液时，会随衣袖的抖动落入培养基，造成破圈或者无抑菌圈。所以配制抗 生素溶液应单独使用一套工作服。 2.2 培养基与缓冲液的配制 配制培养基与缓冲液时要按照文献的配比用量，配制后调节其pH值。因为在pH值、盐浓度的影响下，即使琼脂培养基上的两个相邻的小管距离足够，还是可能会出现卵圆形抑菌圈。例如四环素易受pH值影响，链霉素易受盐浓度影响[2]。培养基可以购买厂家生产的产品，因为大批量产品中的成分配比较稳 定，可比性较强。116℃湿热灭菌20min后备用。 3. 加注培养基 3.1 加注底层培养基 无菌室工作台面可能因为使用时间已久，变得凹凸不平或者倾斜，会影响培养基菌层的厚度均匀性。菌层越薄，形成的抑菌圈越大，会给试验造成很大的误差。我们可以在桌面上放置一块足够大的玻璃平板，保证双碟放置区域的平整。在双碟底部预先标记样品的高低浓度区域，在加注培养基底层的时候，有顺序地按照一致方向排列。接下来加注培养基菌层的时候，仍然按照原来的位置与方向排列。这样，即使桌面不够水平，还是能够保证培养基菌层是在水 平的培养基底层上铺开，达到消除误差的目的。 试验中加注的培养基如果温度太低，就容易在内部结块，或者加注到双碟之后不能及时铺开，使得培养基表面为非水平面，会给试验带来误差。加注60～80℃的培养基底层之后，不应立即给双碟加盖。因为温度过高的培养基会形成大量的水蒸气，在双碟盖上凝集并滴落在已经凝固定的培养基底层上，会给培 养基菌层的加注带来影响。 3.2 加注培养基菌层 制备琼脂培养基菌层时，培养基温度过高或者受热时间太长都会导致试验菌死亡。当菌种为非芽孢杆菌的时候，现象尤为明显，甚至会出现无菌生长。因此，培养基应放在50℃水浴中保温。当加入试验菌种混匀后，应尽快加注到底层培养基上。在试验的时候，如果从大瓶内用刻度吸管吸取带菌培养基，吸管中培养基量少极易冷却，加在底层培养基上就不易均匀铺开，导致菌层厚度不均，影响到抑菌圈的直径。因此可以事先把配制好的培养基分装在具塞试管内，每管5mL，湿热灭菌后放在50℃水浴锅内保温。试验中，再分别加入菌液混匀，配制成带菌琼脂。震荡混匀后继续保温5