样品与盖玻片紧贴程度对样品荧光的影响在激光共聚焦试验过程中.PDF

样品与盖玻片紧贴程度对样品荧光的影响 在激光共聚焦实验过程中，需要使用一种很薄的盖玻片用以承载样品，厚度 约为120µm 到170µm，样品与盖玻片之间的紧贴程度会直接影响到样品的的荧光 观察，有时还会产生假象。 对于细胞样品，一般情况下，细胞培养在confocal 皿中，细胞在confocal 皿底部的盖玻片上贴壁生长，细胞与盖玻片紧密贴合，观察到的细胞荧光是样品 真实情况；一些固体颗粒、粉末或液体样品，如与盖玻片紧密贴合，观察到的样 品荧光也都是真实荧光；但对于一些膜类样品，如样品较厚且表面不平整，与盖 玻片不能紧密贴合，就会出现无法对样品聚焦或产生荧光假象的情况。现以一 PDMS 膜举例，在此膜上有一些条纹图案，里面含有发荧光量子点，目的是观察 量子点是否包裹在PDMS 膜上的条纹图案中。PDMS 膜与盖玻片的紧贴程度会影响 条纹图案中量子点荧光的观察。 1、PDMS 膜与盖玻片紧贴良好 40X 40X 图1.1 PDMS 膜条纹图案，左图为荧光图，激发波长559nm，发射波长范围570-670nm；右图为DIC 40X （微分干涉差）图，观察样品形貌。 注：所用共聚焦为Olympus FV1000-IX81，显微镜为倒置荧光显微镜。图片左下角的数字反映了物镜与样 品的相对距离，数值越大，镜头越往上移，与盖玻片的距离越近；右下角为所用物镜的放大倍率。此篇通 讯所有共聚焦图，在40X 物镜下，荧光图采集参数完全相同。 304.42µm 40X 40X 图1.2. 盖玻片下表面荧光图 图1.3. PDMS 膜 在PDMS 膜覆盖处，PDMS 膜与盖玻片上表面紧密接触，在同一焦平面上。 PDMS 薄膜上条纹图案中的量子点发荧光，如图1.1 所示。盖玻片下表面荧光可 见，如图1.2，盖玻片上表面与PDMS 膜紧密接触，观察不到盖玻片上表面荧光。 2. PDMS 膜与盖玻片之间有空隙，膜下表面与盖玻片不是紧密贴合 40X 40X 图2.1. PDMS 膜条纹图案荧光 324µm 40X 447µm 40X 图2.2. 盖玻片下表面荧光图 图2.3. 盖玻片上表面荧光图 当PDMS 膜与盖玻片之间有空隙，紧贴程度不太好时，PDMS 膜下表面与盖 玻片的上表面不在一个焦平面上，条纹处量子点的荧光很弱，图2.1 所示。原因 可能是激光穿透盖玻片后在PDMS 膜上下两个面进行反射、折射，使得经过PDMS 膜上下两个面的激光发生相消干涉，激光不能进入条纹处，因此条纹处没有荧光。 是否发生激光的相消干涉与PDMS 膜厚度、膜与盖玻片之间的空隙以及激光波长 都有关系。另外还发现：PDMS 膜条纹外有荧光，这应该是假象，因为在第一种 情况下，膜与盖玻片紧密贴合，PDMS 膜条纹外没有荧光，如图1.1 所示。怀疑 是盖玻片上表面荧光在膜下表面发生反射后的荧光假象。从图2.2、图2.3 可观 察到盖玻片上下两个表面的荧光，盖玻片厚度约为120 微米。盖玻片上表面与 PDMS 膜约相距60 微米。 3、PDMS 膜与盖玻片中间夹了一层盖玻片，加大空隙 图3.1. PDMS 膜 20X 20X 图3.2. 盖玻片下表面荧光图 图3.3. 盖玻片上表面荧光图 20X 20X 图3.4.