激光共聚焦显微镜快速入门-北京生命科学研究所.PDF

共聚焦显微镜快速入门 占 成 Zhancheng@nibs.ac.cn 北京生命科学研究所 共聚焦显微镜历史简介 共聚焦显微镜原理简介 LSM 510 META系统简介 LSM 510 META快速上手 影像中心的管理规定简介 — 北京生命科学研究所— 共聚焦显微镜历史简介 — 北京生命科学研究所— 传统显微镜的缺憾 在传统的荧光显微镜中， 来自汞灯或者氙灯的激 发光照射视野中的全部 样品，观察者可以用眼 睛直接观察，也可以用 CCD等设备直接拍摄荧光 图像。 传统显微镜得到的图片 容易受到轴向干扰和侧 向干扰的影响而显得有 些模糊。 — 北京生命科学研究所— 焦点模糊 对于有一定厚度的样品（大于2微米），一方面，由于 在物镜聚焦平面上下的平面上也有荧光被激发，焦平 面上的荧光图像将有一定的模糊，这被称为轴向（Z） 干扰； 另一方面，感兴趣区域的样品也会受到同一焦平面上 邻近区域所激发的荧光的干扰，使得图像的对比度降 低，这被称为侧向（XY）干扰。 — 北京生命科学研究所— 共聚焦显微镜优势 共聚焦显微镜很好的解 决了传统荧光显微镜中 焦面模糊的问题，解决 了图像的轴向和侧向的 干扰。 共聚焦显微镜同时还提 供了光切能力，能对厚 样品（例如花粉颗粒， 果蝇大脑等）进行三维 层切成像。 — 北京生命科学研究所— 共聚焦显微镜发展历史 1955年，Marvin Minsky利用共焦原理搭建了一台共焦 显微镜，用来在体观察大脑的神经元网络。 1957年，Marvin Minsky申请了共聚焦显微镜的专利。 1970年，第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世。 1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可 以消除焦点模糊，得到清晰的图像。 1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显 微镜。 — 北京生命科学研究所— 由于目前多数共聚焦显微镜所用光源为激光， 成像方式为逐点扫描成像，因此又被称为 “laser scanning confocal microscope”,“激 光扫描共聚焦显微镜”。 激光共聚焦扫描显微镜发展至今，已经不再是 普通的光学显微镜，而是光学显微镜与激光， 高灵敏度探测器，高性能计算机和数字图像处 理软件相结合的新型高精度显微成像系统。 — 北京生命科学研究所— 共聚焦显微镜原理简介 — 北京生命科学研究所— 共聚焦与传统显微镜的原理差别 照明方式不同：传统显 微镜是一次性照明整个 视野中的样品，因此可 以用眼睛直接观察或者 用CCD获取图像，没有时 间延迟；而共聚焦显微 镜是逐点成像，无法用 眼睛成像，也无法用CCD 获取图像，只能用探测 器收集每个象素点的信 号，再通过软件重构图 象，有一定的时间延迟。 — 北京生命科学研究所— Pinhole的作用 共聚焦显微镜在探测器 前放置一个pinhole小孔， 用来阻止非焦面的信号， 同时通过焦面的信号， 以消除焦点模糊。正是 因为pinhole小孔的存在， 共聚焦显微镜具有了光 切能力，能对厚样品进 行三维层切成像。