[信息与通信]实时荧光定量PCR技术原理与应用.pdf

东胜创新技术通讯 Eastwin Technical Notes───────── 实时荧光定量PCR专辑 年20044月 综述 METHODS 25, 383–385 (2001) doi:10.1006/meth.2001.1260, available online at on 实时荧光定量PCR Thomas D. Schmittgen Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Washington State University, Pullman, WA 99164. 对于从90 年代初就开始接触定量PCR 的实验人员来说，他们早已对繁琐的定量方法习以为常。早期定量PCR 技 术的难点主要在于：（1）如何确定 PCR 正处于线性扩增范围内 （只有在此范围内PCR 产物信号才与初始模板的拷贝 数成比例）。（2 ）一旦线性扩增范围确定以后，如何找到一个合适的方法检测结果。为了保证线性，研究者要扩增一系 (1) (2) (3) 列梯度稀释的cDNA 或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整 ；有的研究者加一个竞争性模板 ，有的做限制性 (4) (5) 的稀释梯度分析 ，或者加一个PCR 模拟 （mimic ）反应，即用相似的引物与目标产物共扩增 。而扩增产物的检测通 常在跑胶以后通过染料，放射活性或者探针进行检测。 对于已经开始使用实时定量 PCR 的研究者来说，过去的日子已经一去不复返了。在实时PCR 中，不再需要担心 扩增的线性和放射性污染，也不再需要跑胶和手工收集数据。现在在2 到3 小时之内拿到数据已经不再是梦想。除此 之外，实时PCR 还有其它的一些优点：灵敏度大大提高；可以实现高通量；所有实验在封闭系统内完成，可变因素大 大减少；可以进行多重PCR 反应，而且不需要后期处理。 PCR 实时检测技术从诞生到现在已经有五年了，但是其应用在近两年才开始迅猛增长。在Medline 数据库中，用 “Taqman ”或“real-time and PCR”作为关键词有哪些信誉好的足球投注网站，在 1996 年有 19 篇文章，在 1997 年有28 篇文章，在 1998、1999、 2000 年文章数分别达到了 52、157 和409 篇。在这篇文章写作的同时，在 2001 年已经可以找到551 篇文章了。许多 厂商也正在大力宣传实时荧光定量 PCR 仪及其相关的技术 （包括软件、探针等），而且在不久的将来，会有更多的产 品发布。针对实时定量PCR 这一热点领域，我们收集了许多目前用实时定量PCR 来定量DNA 或RNA 的方法，汇编 成9 篇文章，涵盖了从mRNA 和病毒DNA 定量到DNA 的甲基化和单核甘酸多态性的扩增检测。 Giulietti等人描述了通过实时PCR对cytokine基因表达进行定量的方法。因为这一类基因在免疫的诸多方面都起着 非常重要的作用，读者会发现这篇文章非常有用，特别是文中列出了许多cytokine基因和看家基因的引物和探针序列。 就象大多数方法一样，这篇文章描述的定量检测cytokine基因表达的方法可以外推检测许多不同种类的mRNA 。同时这 篇文章也对实时定量PCR做了一个很好的综述，包括探针的化学原理和仪器介绍。我们推荐这个领域的所有新手应该 先读读这篇文章。 对于DNA 或RNA 的常规定量来说，有两种定量方法：绝对定量和相对定量。绝对定量检测模板数的精确拷贝数， 通常要用到标准曲线。在 Niesters 的文章里讨论了绝对定量用于病毒载量分析的方法。而相对定量能给出样本间基因 表达的差异，比如说经过处理的样本和未经处理的对照。通常，给出基因表达的相对变化就足够说明问题了，并不需 要给出绝对量的变化。因为不要做标准曲线，基因表达的相对变化分析比绝对定量的方法更省时。对于那些想得到相