[农学]分子生物学课件第14讲.ppt

三、嵌合剂的致突变作用 四、转座成分的致突变作用 五、增变基因 六、紫外线的致突变作 七、突变热点 （一）突变热点的检测 （二）突变热点形成的机制 1，5-甲基胞嘧（MeC）啶造成的突变热 （1）MeC的形成及脱氨氧化 （2）DNA复制的不同时期MeC脱氨氧化的后果 2，短的连续重复序列造成的突变热点 3，不同突变剂造成的突变热点不同 第五节 离体定向诱变 一、寡核苷酸引物诱变 （一）定点突变基因的克隆过程 1，正链DNA的制备 2，突变引物的合 3，异源双链DNA分子的制备 4，转化宿主 5，突变体的筛选 （1）限制位点筛选法 （2）杂交筛选法 （3）生物学筛选法 6，突变基因的鉴定 （二）提高寡核苷酸引物诱变效率的方法 1，Kunkel定点诱变法 脱氧尿苷三磷酸酶缺陷（dut-）和尿嘧啶-N-糖基酶缺陷（ung-）大肠杆菌的特点：可以合成掺U的DNA分 2，硫代磷酸诱变法 一些核酸内切限制酶无法切割硫代磷酸DNA分子 二、PCR诱变法—— 大引物诱变法（megaprimer method of mutagenesis） 三、盒式诱变 原理：当靶DNA序列两侧存在两个限制性酶切位点时，两者之间的DNA序列就可以被酶切去除，并由一段人工合成的具有突变位点的寡核苷酸片段取代野生型基因中的相应序 第五章 原核生物基因表达的调控 第一节 概述 一、原核生物的特点 二、原核生物基因表达的调控方式 1，DNA水平的调控 2，转录水平的调控 3，翻译水平的调控 第二节 正控制和负控制 一、正控制（positive control）系统和负控制（negative control）系统 （一）负控制系统 1，负控制系统定义 2，阻遏蛋白（repressor） （二）正控制系统 1，正控制系统定义 2，激活物（activator） （三）正、负控制系统的进化 1，负控制系统的进化 2，正控制系统的进化 （四）几个与基因调控相关的概念 1，反式作用产物（trans-acting porduct）：任何可以以自由扩散的方式找到其作用目标的基因产物（蛋白质或RNA）称为反式作用产物 2，反式作用 3，顺式作用序列（cis-acting sequence）：任何只能以DNA序列的形式，而不能通过其他形式在原位发生作用，进而影响与其物理相连的DNA序列的DNA序列 4，顺式作用 二、正、负控制系统对操纵元的控制 （一）可诱导操纵元及可阻遏操纵元 1，可诱导操纵元(incucible operon) （1）可诱导操纵元的定义 加入对基因表达有调节作用的小分子后，基因的转录活性开启的操纵元 （2）诱导（induction） 加入对基因表达有调节作用的小分子，使基因的转录活性开启的作用和过程 （3）诱导物（inducer） 产生诱导作用的小分子 可能的作用方式：使无活性的激活物激活或使有活性的阻遏蛋白失活 2， 可阻遏操纵元（repressible operon） （1）可阻遏操纵元的定义 加入对基因表达有调节作用的小分子后，基因的转录活性关闭的操纵元 （2）阻遏（repression） 加入对基因表达有调节作用的小分子，使基因的转录活性关闭的作用和过程 （3）辅阻遏物（corepressor） 产生阻遏作用的小分子 可能的作用方式：使有活性的激活物失活或使无活性的阻遏蛋白激活 （二）操纵元的状态 1，转录活性开放 被诱导 除阻遏 2，转录活性关闭 未被诱导 阻遏 3，正、负控制操纵元的状态（图8－1） 负控制操纵元的诱导和阻遏 正控制操纵元的诱导和阻遏 不可诱导 / 超阻遏：某些情况下，调节蛋白质突变，使可诱导的操纵元变为不可诱导；某些情况下，可阻遏的操纵元变为不能除阻遏，即超阻遏 组成型表达：某些情况下，操纵元的表达失去调节蛋白的控制或不受调控 （三）正、负控制系统的遗传学特征 1，负控制系统的特征 阻遏蛋白的失活产生隐性的组成型表达 2，正控制系统的特征 激活物的失活导致不可诱导或超阻遏状态 第二节 操纵元的原型——乳糖操纵元 一、操纵元模型的提出 （一）酶的诱导及阻遏现象 2，细菌色氨酸合成酶合成的阻遏 3，安慰诱导物 具有诱导效应，而本身又不被分解的诱导物 （二）大肠杆菌乳糖代谢系统 1，乳糖代谢相关酶及其基因 （1）乳糖代谢相关酶 β-半乳糖苷酶：活性形式为4聚体，分子量约500KD，水解β-半乳糖苷分解成为单糖分子 β-半乳糖苷透性酶：为转运系统的膜结合蛋白组分，分子量约30KD，负责将β-半乳糖苷转运入细胞 β-半乳糖苷乙酰基转移酶：能将乙酰基从乙酰辅酶A分子上转移到β-半乳糖苷上。 （2）lacZYA基因 由一个共同的调控系统（启动子等）控制 由一个共同的转录产物（mRNA）依次翻译产生三个基因的产物 2，lacZYA系统的突变体研