[农学]实时荧光定量PCR介绍.ppt

February 20, 2018 实时荧光定量PCR介绍 宝生物工程（大连）有限公司 主 要 内 容 Real Time PCR基础知识 Real Time PCR的用途 Real Time PCR的原理 使用Real Time PCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。 Real Time PCR Real Time PCR基础知识 TaqManProbe Cycling Probe Molecular Beacon etc. SYBR Green I 荧光染料嵌合法 荧光探针法 Real Time PCR的检测方法 荧光染料嵌合法（SYBR Green I） SYBR Green I：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。 SYBR Green I F SYBR Green I 法作用机理示意图 TaqMan法作用机理 TaqMan探针为一寡核苷酸， 5’ 端标记一个报告基团（Reporter）， 3’ 端标记一个淬灭基团（Quencher）。 Q TaqMan Probe法原理示意图 SYBR Green I 法与Probe法比较 常用于mRNA表达量分析等 SYBR Green I 法 简便易行 价格便宜 要求反应的特异性 不能进行多重PCR 常用于SNP解析，病毒、病源菌检测 主 要 内 容 RT Primer的选择 Random Primer Oligo dT Primer Gene Specific Primer Random 6mer Primer Gene Specific Primer Oligo dT Primer PCR R-Primer PCR F-Primer RT Primer的选择 Real Time PCR引物设计 目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。 目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。 Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同 = 对引物设计要求严格 普通PCR引物 Real Time PCR引物 Real Time PCR引物设计原则 Real Time PCR用TaqMan探针设计原则 Real Time PCR探针设计原则 线性关系、扩增效率确认 检测灵敏度确认 PCR扩增效率（E）：0.8-1.2 35Cycles内可得到好的定量结果。 如果采用SYBR检测方法，30Cycles内无非特异性产物扩增。 相关系数（r2）：大于0.98 反应性能确认 主 要 内 容 标准曲线制作 扩增曲线 标准曲线 标准品梯度的选择：5～6个梯度 标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为10 105 104 103 102 101 100 标准品的种类 质粒标准品构建流程 基因组DNA PCR 目的基因克隆 目的基因 目的基因 目的基因 质粒 质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。 体外转录RNA标准品构建流程 RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。 T7 RNA polymerase 体外转录RNA Total RNA PCR cDNA RT T7 Promoter TTTT•••T PCR产物 目的基因 目的基因 目的基因 AAAA•••A AAAA•••A 理想的标准品扩增曲线 基线平整 Negative Control为水平线 指数区较明显，陡度大 平台区汇于一起 线性范围宽 理想的标准曲线 相关系数（r2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.8-1.2，越接近1，越理想。 扩增效率 相关系数 扩增效率（E）计算方法 标准曲线X轴表示起始模板浓度（log10)，Y轴表示Ct值时 E=10-1/a-1 标准曲线X轴表示Ct值，Y轴表示起始模板浓度（log10) E=10-a-1 Real Time PCR解析方法 融解曲线分析 Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度。 SYBR Green I 法进行检出时， 要根据融解曲线确认PCR产物的特异性。 特异性产物 非特异产物 引物二聚体 对PCR产物特异性进行分析