[农学]总RNA的提取和RT-PCR.ppt

实 验 总RNA的提取与RT-PCR 完整RNA的提取和纯化,是进行RNA 方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。 掌握从细胞中提取总RNA的方法 掌握RT-PCR基因扩增的原理和操作方法 实 验 流 程 第一部分 细胞总RNA的提取 操作步骤 原 理 10-5mg RNA/细胞 mRNA 3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA) 结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。 目前常用的是Trizol法。 原 理：Trizol的主要成分 Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂 主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。 酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。 原 理 在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。 取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 仪器和主要试剂 1. 微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管 2. TRIpure试剂 3. 氯仿 4. 异丙醇 5. 75℅乙醇 6. 无RNase的水(溶液均需用DEPC处理过的水配制) 关 键 点 所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点： 样品细胞或组织的有效破碎； 有效地使核蛋白复合体变性； 对内源ＲＮＡ酶的有效抑制； 有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离； 对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。 RNA酶污染来源 RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。 严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。 最大限度地抑制内源性的RNA酶：而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。 防止RNA酶污染的措施 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。 塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。 配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。 RNA完整性检测 完整的RNA的电泳可明显地观察到28S和18S两条带，并且28S大约是18S的两倍宽。 若两条带不明显, 则说明RNA部分降解,可能的原因是污染了RNase。 常见问题分析 RNA降解 A.组织取出后没有马上处理或冷冻。 B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。 C.细胞在用胰酶处理时过度。 D.溶液或离心管未经RNase去除处理。 E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5 。 DNA污染 A.样品匀浆时加的试剂量太少 B.样品中含有有机溶剂(如乙醇，DMSO等)，强缓冲液或碱性溶液 第二部分逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR) 仪器和主要试剂 基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管 总RNA 第一链cDNA合成试剂盒 （含有逆转录酶、RNA酶抑制剂、缓冲液） dNTP mix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2 mmol/L Taq DNA聚合酶 操作步骤 原 理 提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。 RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。 该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温