[农林牧渔]生物技术大实验.doc

《生物技术大实验》实验指导书 生物技术教学部 常平安 舒坤贤 谢永芳 编 重庆邮电学院生物信息学院 2005年3月1日 前 言 《生物技术大实验》是为生物技术专业本科高年级学生开设的综合实验课程，是在普通生物学实验、生物化学实验、微生物实验、细胞生物学和遗传学实验的基础上的综合实验课程。该实验课程偏重于分子生物学实验教学，通过此实验课程，学生不仅学习到最基本的分子生物学技术，而且学习到前沿的生物技术。 分子生物学实验技术突飞猛进，日新月异。分子生物学技术的广泛应用，在20世纪下半叶对生命科学的进步产生了举世公认的巨大推动作用，而且对人们的生活和整个社会的发展亦产生了巨大的冲击和影响。分子生物学技术已广泛渗透和应用到生物学、遗传学、细胞学、微生物学、进化学、肿瘤学、免疫学、药理学、发育学、病毒学、神经生物学、生药学、法医学等与基础医学和临床医学有关的研究领域。21世纪将更是分子生物学技术快速发展的时期，由此引起的生物技术革命并将更加深刻地影响社会的发展。 学生基本技能和动手能力的培养都离不开实验室，离不开实验课上的训练，很多理论上的原理都需要到实验课上去验证，很多理论上的知识都需要到实验课上去实践。而实验课教材或实验指导书是开好实验课的基本条件之一。 虽然目前的分子生物学实验教材版本众多，但针对本科生的生物技术大实验教材尚无出版。为了加强本学科的教材建设，促进本学科实验课的开设，我们参考了国内外必威体育精装版的有关分子生物学实验技术的专著，根据我校学生的特点及我们自己现有的基础和条件，特选择了部分实验内容，并结合我们的经验与体会，汇编成了生物技术大实验实验指导书，以供参考。在使用过程中，可根据不同的层次适当增减。同时，对于新近产生和应用前景广阔的生物芯片技术、RNAi技术和蛋白质组研究等，限于我们目前的条件，只能作些演示或作为动态给以介绍，条件一经成熟，即行开设。 由于分子生物学技术和生物技术的快速发展，加之我们是第一次这样系统地给学生开设生物技术大试验课程，许多工作还处于不断探索的过程中，难免有不妥和疏漏之处，恳切期望读者提出宝贵意见，以利不断修正完善。 编 者 2005年3月 目 录 实验一 质粒的提取和纯化 ……………………………………………. 3 实验二 质粒DNA的电泳和纯度检测…………….……………………..6 实验三 PCR产物的TA克隆……………………………………………...9 实验四 感受态大肠杆菌细胞的制备…………………………………...12 实验五 重组DNA转化大肠杆菌…………………………………12 实验六 PCR扩增基因特异片段………………………………………..15 实验七 DNA片段的回收及纯化………………………………………..19 实验八 PCR法快速鉴定重组载体……………………………………...22 实验九 限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒…………………………...24 实验十 外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测……………………….28 实验十一 RNA的提取及其纯度检测……………………………………32 实验十二 逆转录PCR（RT-PCR）扩增基因特异片段…………………..35 实验十三 DNA探针制备……………………………………………..…38 实验十四 Southern印迹杂交……………………………………………41 实验十五 Northern印迹杂交……………………………………………44 实验十六 荧光原位杂交（FISH）技术…………………………………47 实验十七 外源基因在哺乳细胞中的表达及其检测…………………...50 实验十八 生物芯片技术………………………………………………...53 实验十九 RNAi技术……………………………………………………56 实验二十 蛋白质组技术………………………………………………...58 附录 基因工程基本技术路线…………………………………………….60 实验一 质粒的提取和纯化 实验目的：了解碱裂解法制备质粒的原理，掌握质粒的小量制备方法。 实验原理：质粒DNA的抽提是基因工程操作中最常用与最基本的技术，现已有多种成熟的方案可供选择。最常用的有利用碱性条件下质粒DNA与染色体DNA变复性的不同进行分离的碱法；利用酸性、低离子强度时超螺旋在水相中，开环、线型分子在酚相中进行分离的酸酚法；利用羟基磷灰石在特定的条件下(8mol／L尿素，0.24mol／L磷酸缓冲液pH＝6.8)只吸附双链DNA的羟基磷灰石法(在上述条件下染色体DNA均成单链，质粒DNA保持双链)等。本实验选做的是碱法。