[临床医学]复制-1.pptVIP

第五章 DNA的复制(DNA Replication );复制子(Replicon，复制单位或复制元) DNA中含有一定复制起点和复制终点的复制单位。 复制子的长度大小不均，1.3万—90万bp不等。 ;DNA的半保留复制（Semi-Conservation Replication） ;;;验证半保留复制的实验;; 图11-4 Taylor 蚕豆根尖放射自显影实验。(a)按半保留复制预期DNA在复制过程中标记情况；(b)实验结果染色体放射自显影的图示。;;;;第二节 参与DNA复制的酶和蛋白;;二、复制的酶系统; 表11-1 E.coli 中的三种DNA多聚酶 ;;2.DNA聚合酶的结构和功能;;;3、DNA聚合酶Ⅰ的功能; 1. 5‘→3’聚合功能 2. 3‘→5’外切活性 3. 5‘→3’外切活性 (1)切口平移（nick translation）； (2)链的置换； (3)模板转换（template-switching） 4. 内切酶活性 ;;;;;4、DNA多聚酶Ⅲ的结构;;;DNA pol Ⅲ全酶在DNA上的装配分为三个阶段：;（二） DNA连接酶;（三） 单链结合蛋白;（四）解旋酶(helicase);(五）DNA拓扑异构酶(topoisomerase);第三节 复制的起点、方向和终点;;;不同步培养时各标记的拷贝数不同,复制起点标记的拷贝数应最多;;二、不同生物复制起点和方向;;D环复制;三、原核生物，噬菌体和病毒的复制起始和终止;;E.coli复制起始区的结构特点是：;复制起始的简单步骤：;;;;;;;;2、单链DNA的复制：1968年Gilbert提出滚环复制模型:;; 滚环复制的电镜照片; 哪些DNA进行滚环复制?;;;;;（二）线状DNA复制;DNA中间起始复制;;DNA末端起始复制;;;（三）复制的终止;;2.线性DNA的复制终止;;第四节 复制的过程;;;冈崎实验; （1）脉冲标记实验（pulse-labeling experiment） 以E.coli为材料，在培养时，培养基中加入同位素[3H]标记的dTTP，经30秒后，DNA刚开始复制，分离DNA，然后在碱中沉淀，变性，让新合成的单链和模板链分开，再用CsCl密度梯度离心，以沉降的快慢来确定片段的大小，再检测放射标记，结果表明被3H标记的片段，也就是新合成的片段，沉淀系数为20S左右，即都是长1000~2000Nt的DNA片段，而亲本链要比它大20~50倍。; （2）脉冲追逐实验 早期合成的DNA片段以后的命运又是如何的？是依然如旧的短片段，还是连接成了长片段。这个实验是先进行标记培养30秒，以后除去同位素继续培养几分钟，再分离DNA在碱中沉淀，检测结果。先合成的（带标记）的DNA不再是短片段，而和总DNA的情况相似，沉淀系数为70S~120S较长的片段，这意味着刚开始合成的片段都是短片段，以后再连接成长片段，人们就把最初合成的短片段称为冈崎片段（Okazaki fragment）。 ;细胞内都存在有dTTP和dUTP，而DNApolⅢ却并不能区分它们，因此也会将dUTP加入到DNA中，形成A·U对。那么在DNA中为什么没有U的存在呢？这是因为E.coli细胞里有双重“保险”，防止了U的“混入”。第一道关是细胞里的dUTPase，它能使dUTP变成dUMP，dUMP是不能作为DNA合成的底物，这样它就不再能加入DNA中。; 第二道关是尿嘧啶N-糖苷酶（uracil N-glycosylase），它可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无Pu和Py位点（apurinic or apyrimidinic ，AP），再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。在细胞内尿嘧啶N-糖苷酶作用较快，而AP酶作用较慢，在新链合成之初约1200bp就有可能掺进一个U，但很快就被尿嘧啶N-糖苷酶切断糖苷键，在AP酶未作用前在脉冲标记实验中就提取了，用NaOH沉淀时，AP位点十分易断裂，所以前导链也成了小片段。 ;E.colidUTPase，它能使dUTP变成dUMP，dUMP是不能作为DNA合成的底物，这样它就不再能加入DNA中。 尿嘧啶N-糖苷酶（uracil N-glycosylase），它可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无Pu和Py位点（apurinic or apyrimidinic ，AP），再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。;实验证实;2、复制过程;;复制过程的特征： ;3、链的延伸;;双螺旋复制是同时复制的：①每一个复制叉含有特别大的多聚体Ⅲ复合体，它是一个不对称的二聚体，可能