生物技术实践-专题4.pptVIP

3．血红蛋白的提取与分离 (1)常用的蛋白质分离方法 ①凝胶色谱法 凝胶色谱法分离蛋白质的原理 分析比较列表如下： 　 　蛋白质 比较　　　 相对分子质量大 相对分子质量小 行进过程 排阻在凝胶颗粒 外面，迅速通过 进入凝胶颗粒 内部，被滞留 运动方式 垂直向下 垂直向下和无 规则扩散运动 运动路程 较短 较长 洗脱次序 先流出 后流出 ②电泳法原理：在一定pH下，一些生物大分子(如多肽、核酸等)可解离的基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。由于分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 (2)实验流程 第一步　样品处理 ①红细胞的洗涤：除去血浆蛋白等杂质，有利于后续步骤的分离纯化； ②血红蛋白的释放：使红细胞破裂，血红蛋白释放出来； ④图示： ⑤注意：透析时间为12 h。透析袋是用硝酸纤维素制成，小分子可自由进出，而大分子保留在袋内。 第三步　纯化 一般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化。 ⑤注意：透析时间为12 h。透析袋是用硝酸纤维素制成，小分子可自由进出，而大分子保留在袋内。 第三步　纯化 一般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化。 第四步　纯度鉴定 一般用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，来测定蛋白质的分子量，即对血红蛋白进行纯度鉴定。 (3)结果分析与评价 ①血红蛋白的提取和分离时红细胞分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。 ②凝胶的装填标准是紧密、均匀。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 ③G-75：“G”代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5 g。 ④装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的是使凝胶装填紧密。 ⑤实验过程中加入柠檬酸钠的目的是防止血液凝固；低速、短时离心防止白细胞沉淀；缓慢搅拌防止红细胞破裂释放出血红蛋白。 下列有关提取和分离血红蛋白的叙述中，不正确的是 (　　) A．样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液 B．通过透析可以去除样品中相对分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取 C．可以通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂蛋白除去，即样品的纯化 D.可以通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度 B [解析]样品处理是洗涤红细胞，使血红蛋白释放出来，通过离心法得到血红蛋白溶液。透析袋能使小分子自由进出，则大分子留在袋内，这样可以去除样品中相对分子质量较小的杂质。当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时,这些蛋白质分子就可以分离开。判断纯化的蛋白质是否达到要求,通常用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法对蛋白质的纯度进行鉴定。 2．在DNA粗提取与鉴定实验中，将获得的含有DNA的黏稠物(含较多物质)分别处理如下： 其中杂质所处的位置在(　　) A．①④⑤　　　　　　　　 B．①③⑥ C．①④⑥ D．②④⑥ 操作过程 黏稠物 滤液 放入2 mol/L的氯化钠溶液中，搅拌后过滤 ① ② 放入0.14 mol/L的氯化钠溶液中，搅拌后过滤 ③ ④ 放入冷却的95%的酒精溶液中，搅拌后过滤 ⑤ ⑥ C 解析：在2 mol/L的氯化钠溶液中，DNA溶解而杂质在黏稠物中；在0.14 mol/L的氯化钠溶液中，DNA溶解度小而析出，杂质在滤液中；在95%的酒精溶液中，DNA析出而杂质溶于酒精中。 1．(2013·高考江苏卷)小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷， 可选择性扩增抗体的可变区基因(目的基因)后再重组表达。下列相关叙述正确的是(多选)(　　) A．设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列 B．用PCR 方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列 C.PCR 体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA 聚合酶 D.一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞 BD 解析：设计引物时应当考虑需扩增的目的基因与载体两端的序列进行互补配对，A项错误；利用PCR技术扩增目的基因只需要知道基因两端的序列，据此设计合适的引物即可，不必知道基因的全部序列，B项正确；PCR体系中应该用耐高温的DNA聚合酶，而不是从受体细胞中提取的普通DNA聚合酶，C项错误；需根据目的基因的编码产物的特性来选择合适的受体细胞，如果是分泌蛋白，则最好选用真核细胞作为受体细胞，D项正确。 2．(2012·高考江苏卷)下列关于“DNA粗提取与鉴定实验”的叙述，正