抗坏血酸的测定方法.doc

抗坏血酸（）的测定方法测定的国标方法中，荧光法为测定食物中含量的第一标准方法，2、4－二硝基苯肼法作为第二法。?一、荧光法?1．原理?样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺（OPDA）反应生成具有荧光的喹喔啉（quinoxaline）,其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。?脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。本方法的最小检出限为0.022?g/ml。?2．适用范围?GB12392-90?本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定?3．仪器?3．1．实验室常用设备。?3．2．荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计。?3．3．打碎机。?4．试剂?本实验用水均为蒸馏水，试剂不加说明均为分析纯试剂。?（1）偏磷酸－乙酸液：称取15g偏磷酸，加入40ml冰乙酸及250ml水，搅拌，放置过夜使之逐渐溶解，加水至500ml。4℃冰箱可保存7～10天。?（2）0.15?mol/L硫酸：取10ml硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1200ml。?（3）偏磷酸－乙酸－硫酸液：以0.15mol/L硫酸液为稀释液，其余同4.1.配制。?（4）50％?乙酸钠溶液：称取500g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），加水至1000ml。?（5）硼酸-乙酸钠溶液：称取3g硼酸，溶于100ml乙酸钠溶液（4.4）中。临用前配制。?（6）?邻苯二胺溶液：称取20mg邻苯二胺，于临用前用水稀释至100ml。?（7）?0.04%百里酚蓝指示剂溶液：称取0.1g百里酚蓝，加0.02mol/L氢氧化钠溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为10.75ml，磨溶后用水稀释至250ml。?变色范围：pH=1.2?红色? pH=2.8?黄色?pH＞4.0?兰色?（8）?活性炭的活化：加200g炭粉于1L?1+9盐酸中，加热回流1~2h，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110~120℃烘箱中干燥，备用。?（9）标准?抗坏血酸标准溶液（1mg/ml）：准确称取50mg抗坏血酸，用溶液（4.1）溶于50ml容量瓶中，并稀释至刻度。?抗坏血酸标准使用液（100μg/ml）:?取10ml抗坏血酸标准液，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml。定容前试pH值，如其pH＞2.2时，则应用溶液（4.3）稀释。?标准曲线的制备：取下述标准溶液（抗坏血酸含量10μg/ml）0.5、1.0、1.5和2.0ml标准系列，取双份分别置于10ml带盖试管中，再用水补充至2.0ml。?5.操作步骤?5.1?样品制备?全部实验过程应避光。?称取100g鲜样，加100g偏磷酸-乙酸溶液，倒入打碎机内打成匀浆，用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度。如呈红色，即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释，若呈黄色或兰色，则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释，使其pH为1.2。匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定。当样品液含量在40~100μg/ml之间，一般取20g匀浆，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml，过滤，滤液备用。?5.2?氧化处理：分别取样品滤液及标准使用液各100ml于带盖三角瓶中，加2g活性炭，用力振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即样品氧化液和标准氧化液，待测定。?5.3?各取5ml标准氧化液于2个50ml容量瓶中，分别标明标准及标准空白。?5.4?各取5ml样品氧化液于2个50ml容量瓶中，分别标明样品及样品空白。?5.5?于标准空白及样品空白溶液中各加5ml硼酸-乙酸钠溶液，混合摇动15min，用水稀释至50ml，在4℃冰箱中放置2h，取出备用。?5.6?于样品及标准溶液中各加入5ml50%乙酸钠溶液，用水稀释至50ml，备用。?5.7?荧光反应?取标准空白溶液，样品空白溶液及（5.6）中样品溶液各2ml，分别置于10ml带盖试管中。在暗室中迅速向各管中加入5ml邻苯二胺，振摇混合，在室温下反应35min，用激发光波长338nm、发射光波长420nm测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算，其直线回归方程供计算时使用。?6.?计算?X=（c×V/m）×F×(100/1000)?式中：X-----样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g；?c------由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度，μg/ml；?m-----试样质量，g；?F------样品溶液的稀释倍数；?V------荧光反应所用试样体积，ml。?例：?测定每一制备溶液的荧光强度。用标准溶液每