新型材分离纯化大鼠内部物材的新型工效.doc

新型材分离纯化大鼠内部物材的新型工效实验方法胰岛分离在Lim方法[2]的基础上改进为用分次消化法。将胰腺剪成约1mm3小块，加入胶原酶溶液，37e水浴振荡消化5min，吸取上层悬液，用4e含10胎牛血清的HBSS（pH718）溶液终止消化。未消化好的组织再加入胶原酶溶液继续消化。重复23次，合计消化1017min.在上述消化过程中动态观察胰岛消化情况，若发现大多数胰岛已完整地从外分泌腺中消化出来，立即终止消化。混匀后用60目筛网过滤。用4eHBSS溶液洗涤2次，取6滴1ml沉淀物镜下做胰岛计数。　　胰岛纯化采用密度1/a梯度离心法。消化后的胰腺组织以DextranT40非连续密度梯度离心纯化，以改良的本室的纯化方法[3]，用D-Hank.s配制浓度为34、22、11的Dextran.将分离的胰腺组织用pH718的Hank.s液洗涤3次，将胰腺组织与高浓度Dextran1B4混合均匀。离心管中依次缓慢加入34辺tran与胰腺组织悬液5ml、22、11辺tran各2ml，最上层铺RPMI1640溶液1ml，室温1000r/min离心5min，1500r/min离心5min.分别收集11与22，11与1640层界面的组织细胞。以pH718的Hank.s液洗涤3次，获得纯化的胰岛。将胰岛悬于10胎牛血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、10mmol/L烟碱、青霉素（100U/ml）、链霉素（80U/ml）的RPMI1640液的培养瓶中，置于37e、5CO2的培养箱中培养。　　胰岛素释放试验精心挑选50个直径为100150Lm纯化的胰岛，置于1ml313mmol/L的克雷伯-林格重碳酸盐缓冲液（KRBB）中，在5CO2、37e条件下孵化10min，然后移到葡萄糖浓度为1617mmol/L的1mlKRBB液中，在同样条件下孵化45min.最后再移到葡萄糖浓度为313mmol/L的1mlKRBB液中，在同样条件下孵化45min.分别收集KRBB溶液，并用间接放射免疫法测定胰岛素含量。　　胰岛细胞移植实验分为3组：正常组，未作任何处理的大鼠；对照组：糖尿病大鼠，未作胰岛移植；移植组：糖尿病大鼠肾被膜下胰岛移植。移植方法：以3戊巴比妥钠麻醉糖尿病SD大鼠，常规消毒，右腹侧壁切口，暴露肾脏，将左肾牵出腹腔固定，于肾下极腹侧进针，以2ml注射器向肾被膜注入约2000个胰岛，关闭腹腔。移植物功能存活的指标：移植术后每天经尾静脉采血，用血糖测定仪测血糖来判断移植胰岛的功能。移植后受者鼠隔日测血糖1次，若连续两次血糖高于1618mmol/L为免疫排斥，以第一次升高时间为排斥时间；血糖低于1112mmol/L为移植物功能存活。　　结果胰岛的分离与纯化胰腺组织剪碎，经过胶原酶消化后可见消化组织呈泥砂样，此时判断消化状况尤为重要：取一滴消化后的胰腺组织悬浮于Hank.s液，倒置显微镜下观察，可清楚地区分胰岛、外分泌组织、淋巴结，胰岛为浅黄色有光泽的椭圆形结节，而外分泌组织、淋巴结显示为灰色无光泽。平均每只Wistar大鼠消化后可获得218114个胰岛。纯化后胰岛可分为4层，纯化后获得182624个胰岛，细胞回收率为（8517519），细胞形态完好，纯化后的胰岛呈球形，几乎没有外分泌部碎片。DTZ染色10min后，在光镜下可见到约95细胞团呈橘红色，纯度高达95；AO/PI染色后，在荧光显微镜下可见到绝大部分细胞团呈绿色，极小部分细胞团或散在的细胞在绿色荧光外有散在的红色荧光点，表明此胰岛制备物的胰岛活性高。　　只有形态的结果并不能说明胰岛有功能。我们进一步应用放免法，通过葡萄糖刺激检测体外胰岛素的释放功能，同时与体内移植分离的高纯度胰岛（大鼠肾被膜下移植）效果的对比来评价胰岛的功能。葡萄糖刺激结果显示，胰岛对高低糖刺激有良好反应性。胰岛移植后80糖尿病大鼠血糖在24h后开始下降，持续79天。由于没有使用免疫抑制剂，所以几天后出现免疫排斥反应，胰岛功能丧失，血糖回升。　　综上所述，我们通过改善消化时间、酶的酸碱度、纯化液的梯度以及纯化时间摸索出室温条件下分离纯化胰岛的方法，便于普通实验室开展工作。