真菌分离以及培养.docVIP

一、（越南进境人参果炭疽病病原菌的分离鉴定2009年第3期 植物检疫 胡 佳 王卫芳¨ ） 1.病原菌分离 采用组织分离法，取病果病健交界果皮组织分离培养(马铃薯葡萄糖琼脂培养基[ PDA]，25℃， 1 2 h荧光与 1 2 h黑暗循环交替)，病菌纯化后保存备用。 2、病原菌培养特征和形态观测 取病果病部组织进行徒手切片，显微观察分生孢子盘和分生孢子的形态特征； 观察病菌的培养特性( P D A， 2 5 o C，1 2 h荧 l 2 h黑暗循环交替)；观测分离物分生孢子的形态和大小； 从培养7 d的菌落中挑取分生孢子团， 配制成孢子悬浮液， 采用载片悬滴法， 观测附着孢的形态及大小。 3、病原菌 1 8 S r D N A序列扩增与测定将纯化菌株置于 P D A、 2 5 o C、 1 2 h荧~／ 1 2 h黑暗循环交替条件下培养 5 d ， 挑取菌落边缘新鲜菌丝，采用常规 C T A B法提取病原菌基因组 D N A作扩增模板， 进行 P C R扩增。所用引物为真菌 1 8 S r D N A通用引物 G e o A 2和 G e o l 1 【 9 J 。反应体系为2 5 总体积，d d H 2 O 1 6 ．3 7 5，1 0倍 P C R缓冲液( 含 Mg C 1 2 ) 2 ． 5 I x L，d N T P( 2 ． 5 mm o l ／ L) 2 L ，G e M1 ( 1 0 I ~ mo l ／ L ) 1 L ， G e o A 2 ( 1 0 l x m o L ／ L ) 1 LT a q ( 5 u ／ l x L ) 0 ． 1 2 5 L， 模板 D N A 2 L 。反应程序为 9 4 ℃ 预变性 2 m i n ， 9 4 o C 4 5 s ， 5 5 o C 4 5 s ， 7 2 o C2 mi n ， 3 0个循环， 7 2 ~ C延伸 1 0 mi n ， 4 ℃ 保存。P C R产物送上海英骏生物有限公司纯化测序。测序结果与 G e n B a n k数据库 中的已知序列进行 B L A S T比较 。 4、致病性测定 选取健康柑橘 ( C i t r u s r e t i c u l a t a) 、 苹果 ( Ma l u s p u mi l a ) 果实， 经 7 0 ％酒精表面消毒后晾干备用。 从在 P D A、 2 5 o C、 1 2 h荧光／ 1 2 h黑暗循环交替条件 下培养 7 d的菌落上挑取分生孢子团， 用无菌水配成分生孢子悬浮液( 1 0 0倍镜下 5 0—6 0个孢子) 。用灭菌针刺伤果皮， 用无菌滤纸片沾取孢子悬浮液覆盖在针刺部位接种， 以无菌水作对照。用保鲜膜分别包裹接种果和对照果， 封口， 放置经 7 0 ％酒精消毒过的塑料箱中， 于2 5 o C、 1 2 h荧光／ 1 2 h黑暗条件下保湿培养， 定期观察症状发展过程。发病的果实按照2的方法重新分离病原菌， 做 K o h n法则确认是否同种致病菌。 二、（苹果炭疽菌低毒性菌株的筛选及控病效果的研究） 炭疽菌培养参照方中达等的方法在含有PDA培养基的试管斜面上接种炭疽菌，7d后用10mL无菌水冲洗抱子再倒入25OmL内有玻璃珠、灭菌的三角烧瓶中(约1又1了个抱子/mL)，置摇床上20min，使抱子团充分分散，涂平板12个待用。涂平板仍参照方中达的方法 苹果炭疽病菌在pH3~10范围的PDA培养基上均能生长和产抱，最适菌丝生长的PH值为4，分生抱子产生的最适pH值为4~5， 三、（东北农业大学农学硕士学位论文 南瓜疫病菌(尸彻toPhthor。。aP:iciLeon.)毒素致病机理及抗源筛选研究） 生物测定法包括幼苗浸渍法、离体叶片浸渍法、叶片针刺、涂抹和喷雾测定、植物愈伤组织测定法、离体根冠细胞测定法、线粒体测定法、叶绿体测定法、细胞膜测定法等。 酶水平的生物测定有ATP酶法、PAL酶法、核糖核酸和脱氧核糖核酸酶法、SOD酶法、POD酶法、MOD酶法。代谢水平的生物测定有种苗偶联能量的测定、苯丙烷类代谢途径的测定、离子吸收测定和C02暗固定测定法等。 与抗性有关的重要的酶类有细胞壁水解酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等，植保素为一些酚类和黄酮类化合物。 2.2.1液体培养基制备 Plich’S培养液:I000ml培养液中含KH2PO4 5g，MgSO4;·7H2O 2.0g，天门冬酰胺1.0g，VB1 0.1g，酵母浸膏5g，蔗糖25g;灭菌前PH调至6.5。 胡萝卜汁培养液:用200g胡萝卜切碎后，煮沸30分钟，经2层纱布过滤后用蒸馏水定容至 100Oml)。灭菌前州调至6.5。 2:2粗毒素的