第3章 新技术育种原理及其进展.ppt

（2）互变异构体（tautomers）的存在引起碱基的错配。C’与A、T’与G、A’与C、G’与T配对。复制时可引起碱基对的转换。在DNA复制中错误引起的突变。 诱变育种原理 ?基因突变的类型（根据遗传信息的变化） 诱变剂的选择 1．碱基类似物和羟胺具有很高的特异性，但很少使用，回复突变率高，效果不大。 2．亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。 4、诱变剂专一性 诱变剂诱导的碱基对取代的专一性已在大肠杆菌中进行了广泛的研究。 NTG诱导的突变99%属碱基转换，其中95%是GC→AT的转换。 甲基磺酸乙酯诱发GC→AT转换突变。 4－硝基喹啉－1－氧化物以90%的概率诱发GC→AT的转换。 紫外线诱发了各种各样的突变，但它太弱，对放线菌不太有用。 无化学诱变剂能以诱发AT →CD的颠换作为主要的诱变方式。 使用化学诱变剂的优缺点： 1、大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。 2、化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射进行工作时，设备费用大，并要注意安全性。 3、大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。 （二）基因工程育种 1973年科恩(Cohen,S.)等人进一步将酶切后的外源DNA 片段与质粒DNA链接起来,构成一个重组质粒(recombinant plasmid),并将这个重组质粒转入大肠杆菌细胞。这些开创性的工作为基因工程建立了一套完整的方法和体系,成为现代生物学发展史上的重要里程碑。 人们能在分子水平上对微生物的初级代谢和次级代谢生物合成中所涉及的各种基因进行深入的研究并进行定向改造，从而大大推动了菌种改良的进程。 通过重组DNA技术提高次级代谢产物产量的主要方法包括: ① 转座突变发生； ② 通过基因工程技术靶向删除和复制基因； ③ 通过原生质体融合进行基因重组。 1、原理和方法 在一个微生物菌种的初级代谢和次级代谢生物合成途径中，常常有少则几个多至几十个基因参与，其中一些编码了限速步骤的酶，这些所谓的关键酶基因表达量的多少直接与生物合成的速率有关。 另外，抗生素等发酵产物的生物合成途径中常会发生旁路代谢，产生一些不需要的副产品或结构类似物，这样，不仅造成生物合成代谢流能量资源的浪费，而且还会对下游的分离纯化和产品的质量带来一定的影响。 从育种的角度考虑，最为重要的是基因的高效表达。？？ 因为目的基因被插入某种载体中，并不意味着这个基因就会表达或能高效表达。 因此，选择一个适宜的高效表达系统，才能保证表达产物能够高效表达。 在众多与生物合成有关的基因中，有些属调节基因，调控了各种酶基因的启动和关闭，它们对最终产物的合成往往是至关重要的。而大多数属结构基因，编码了一些酶基因，通过在一个微生物中导入一些特定的外源酶基因，常常能给这个微生物的生物合成增加新的功能，达到合成新化合物的目的。 方法：（1）通过基因克隆方法，交换或导入相关基因，通过基因量的增加或调控基因能力的加强提高微生物的合成能力；（2）通过阻断不需要的旁路代谢途径增加主要途径的代谢流，从而达到减少副产品，提高主要产量的目的。 建立合适的宿主和载体系统——基因工程菌的稳定性 基因工程菌在传代中常出现质粒不稳定现象。 质粒不稳定可分为两种： 分裂不稳定：是指基因工程菌分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌。 结构不稳定：是指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失，引起基因工程菌性能的改变。 质粒不稳定的产生原因 质粒不稳定常见的是分裂不稳定。 主要与两个因素有关： 一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率。 二是含质粒菌与不含质粒菌的比生长速率差异的 大小。 提高质粒稳定性的方法 工程菌的培养一般采用分成两阶段培养法来提高质粒稳定性。 第一阶段： 第二阶段： 2、转座子突变 （1）调节基因插入失活 正负调节元素都能影响次级代谢物的生产，转座子诱导应该是一个破坏调节基因的有用方法。 通常，破坏负调节基因能导致高产，而破坏正调节基因会降低产量。 可将负调节基因删除并在染色体的中性位点插入正调节基因使其重复来增加产量。 （2）插入失活竞争性的途径 转座子还可以使竞争辅因子等关键前体的一些途径失活，降低能源。 转座子插入诱导的突变谱与诱导剂诱导的不一样，NTG有利于经单一氨基酸取代产生微小的改变，而转座子通过极性效应破坏基因和操纵子，从而导致基因的更改。 （3）随机插入启动子 IS493衍生的转座子具有向外阅