13.-必威体育精装版分子生物学技术.pptxVIP

必威体育精装版分子生物学技术1. Single-Cell genomic/Transcriptome/Proteomics/Metabolomics2. Next Generation Sequencing (NGS)3. Ribosome profiling4. Protein microarray5. Chromosome conformation captureAdvanced molecular biology digs into single-cell level!GenomicsTranscriptomeProteomicsMetabolomicsMicro-pipetting: meiocytes, pollen………Fluorescence activated cell sorting (FACS)MicrofluidicsWhole-genome amplification (WGA)GenomePlex Whole Genome Amplification Next generation sequencing (NGS) Next generation sequencing/Second generation seqeucing/PyrosequencingTraditional sequencing: 384 reads ~1kb / 3 hours454 (Roche): 1M reads 450-1000bp / 10-24 hoursHiSeq (Illumina): 100-200M reads of 50-100bp / 3-8 days * 16 samples SOLiD (Applied Biosystems) 100M reads of 50-60bp / 2-8 days * 12 samplesIon Torrent (Roche): 5-10M reads of 200-400bp / 2 hoursSanger双脱氧链终止法 原理：双脱氧（2，3）-核苷酸可以象2-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3’端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。不能和下一个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来 过程：制备ss-DNA→与引物退火→分为4个反应系统→每个系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸→DNA聚合酶定序反应→反应产物变性后电泳→凝胶干燥→放射自显影。 该法亦适合mRNA的序列分析。 GC富集区常出现“隐影”或“停止”现象，如在反应中加入dITP（脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸-7-脱氧鸟苷可解决GC富集区的测序。ATGCGGTACCAT测序模板5’3’1--dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddATP TA5’5’5’5’5’5’5’5’5’ 5’5’5’TACGCCATACGCCATGGTATAC2--dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddCTPTACGCTACGCC3--dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddGTPTACGTACGCCATGTACGCCATGG四套反应体系4--dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddTTPTTACGCCATTACGCCATGGT2. 自动测序仪 Conney等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。 红色引物+T反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP） 黑色引物+G反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP） 绿色引物+A反应系统（引物+DNA+dNTP+ddATP） 兰色引物+C反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP）Next generation sequencing/Second generation seqeucing/PyrosequencingIllumina sequencingThe Next Generation? When does current generation become last generation, and next generation” become current generation, and can third generation become next generation?? Should we stop saying current and next and start saying first and second?? I like the idea of always having the next gen name.Why Anothe