分子生物学讨论课-DNA测序.pptxVIP

DNA测序技术的原理、发展及在医学中的应用。 DNA测序技术定义：即测定DNA序列的技术。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。20世纪60年代最早尝试20世纪70年代创立加碱法——第一种DNA序列的直接测定发展历程化学降解法——快速测序法20世纪70年代建立双脱氧核苷酸末端终止法——实验室最常用现今荧光DNA序列分析技术——实现测序过程自动化DNA测序技术的方法：1.双脱氧末端终止法2.化学降解法3.DNA序列分析的自动化4.DNA测序技术的发展及在医学中的应用1.双脱氧末端终止法由Sanger等1977年提出。双脱氧末端终止法是现在应用最多的核酸测序技术。主要用于DNA基因分析。操作简便、结果清晰可靠，一次能确定300~500个核苷酸序列。以DNA合成反应为基础。1.1双脱氧末端终止法基本原理：3’端不能跟下一个的5‘端 5’端可以和上一个的3‘端1.2双脱氧末端终止法主要步骤：1.2.1 单链DNA模板的制备1.2.2 DNA模板与测序引物退火1.2.3 掺入法标记反应1.2.4 延伸-终止反应1.2.5 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳1.2.6 放射自显影1.2.7 阅读测序结果阅读测序结果：一般是从下往上阅读X射线片上的显影区带，即从测序引物的5’端读向3‘端。1.2.1 单链DNA模板的制备如果所取DNA为双链DNA，则需经强碱如高浓度NaOH处理，使双链变性解链，形成单链DNA模板。1.2.2 退火退火在PCR中，是指模板双链DNA经热变性、双螺旋解开成单链后，通过缓慢冷却到55℃左右，使引物（即具有互补碱基的RNA片段）与该模板DNA单链重新配对，形成新的双链分子的过程。 1.2.5 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是根据寡核苷酸的大小来分离，因此可将全长产物与不完整的短分子分开。原理：蛋白质或多肽与SDS结合，经热变性和二硫键的还原，形成所带负电荷相对一致的非折叠衍生物，其泳动速度主要由分子量决定。2.化学降解法Maxam和Gilbert（1977）提出化学讲解法。化学降解法是建立在对原有DNA的化学降解过程基础之上的。不需进行酶促反应。一次最多能分析250个核苷酸的DNA序列。它可以分析诸如甲基化等DNA的修饰情况、探测DNA构象和蛋白质-DNA相互作用。2.1化学降解法基本原理：在化学降解法中，单侧末端标记的DNA片段在五组相互独立的化学反应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类被修饰碱基，因此形成五组带有放射性标记的长短不一的DNA混合物。它们的长度取决于该组反应所针对的碱基在原有DNA片段上的位置。然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分别分离这五组DNA混合物，在通过放射性自显影来检测末端标记的DNA链的电泳区带位置。2.2化学降解法主要步骤：2.2.1 目的DNA的制备2.2.2 单侧末端标记待测DNA片段2.2.3 碱基的特异性修饰及化学降解2.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳2.2.5 阅读分析结果2.2.3 碱基的特异性修饰及化学降解G反应G+A反应C+T反应T反应AC反应结果阅读分析：从下往上阅读X射线上的显影区带，即从测序引物的5’端读向3’端G泳道出现区带读作G，G泳道不出现区带而在G+A泳道出现区带读作AC泳道出现区带读作C，C泳道不出现区带而在C+T泳道出现区带则读作TA＞C反应产物泳道出现明显区带，可帮助确定腺嘌呤碱基分析举例：3.DNA序列分析的自动化由Prober JM于1987年提出。用四种不同的荧光化合物分别标记四种反应的产物，就可以做到把四种反应物混合在一起进行电泳，从而大大提高电泳分析的效率，这种方法利用现代精密仪器和计算机技术，实现了DNA测序的高度自动化。以与光敏元件相连的计算机系统为基础。一次最多能分析384个核苷酸的DNA序列。3.1DNA序列分析的自动化的原理和方法在激光的照射下，与存在细微差别的琥珀酸荧光素偶联的ddATP、ddGTP嘌呤环的第七位碳原子以及ddCTP、ddTTP嘧啶环的第五个碳原子所构成的四种双脱氧核苷酸产生不同波长的荧光。采用这四种带有不同荧光染料标记的终止物ddNTP,可以在同一个反应管中进行末端终止测序反应，并于变性聚丙烯酰胺凝胶的同一泳道中进行电泳检测，从而降低了测序泳道间迁移率差异对精确性的影响。在激光的照射下，与存在细微差别的琥珀酸荧光素偶联的ddATP、ddGTP嘌呤环的第七位碳原子以及ddCTP、ddTTP嘧啶环的第五个碳原子所构成的四种双脱氧核苷酸产生不同波长的荧光。采用这四种带有不同荧光染料标记的终止物ddNTP,可以在同一个反应管中进行末端终止测序反应，并于变性聚丙烯酰胺凝胶的同一泳道中进行电泳检测，从而降低了测序泳道间迁移率差异对精确性的影响。荧光偶联法自动DNA测