03_实验三_植物DNA的提取及纯度浓度鉴定.ppt

实验三 植物DNA的提取 实验原理 真核生物DNA与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在于细胞核内 在提取DNA时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，释放出核蛋白 实验原理 ①在核蛋白溶液加入氯仿－异戊醇，振荡，使蛋白质乳化变性，再离心除去变性蛋白质。 ②用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从材料中提取出DNA。 ③用苯酚处理，然后离心分层，蛋白变性后则停留在酚层内。 ① 化学因素 核酸在pH4.0~11.0稳定， 否则就变性降解。 ② 物理因素 DNA是长链线状分子，强机械作用会使DNA分子断裂。 ③ 酶的作用 DNA酶会降解DNA分子。 CTAB CTAB（十六烷基三甲基溴化铵） 阳离子去污剂,它不仅能使蛋白质变性，还能与 核酸形成特异的核酸－CTAB复合物。 核酸－CTAB复合物可溶于≥0.7mol/L NaCl的高 盐缓冲液。 TE 缓冲液 10mmol/L Tris-HCl（pH7.4） 1mmol/L EDTA 思考题 1、本实验中CTAB、EDTA、异丙醇的作用 是什么？ 2、吸取样品、抽提应注意什么？为什么？ 3、提取DNA时除去蛋白质的方法有哪些？ * * 在浓氯化钠溶液（1~2 mol／L）中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小。 在稀氯化钠溶液（0.14 mol／L）中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。 利用不同浓度氯化钠溶液将DNA核蛋白或RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。 实验原理---去除蛋白质的方法 实验原理---破坏DNA完整结构的因素 1、10mL CTAB分离缓冲液加入50mL 小烧杯中， 在65℃水浴中预热。 2、剪碎小白菜叶片， 2组同学称取6g，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。 3、每组称约3g叶片粉末，加入预热的CTAB分离缓冲液，研 磨混匀，再把混合液装入50ml离心管，65℃保温30分钟。 4、加10mL氯仿-异戊醇（24：1），轻轻混匀。 室温，6000 rpm离心8分钟。 实验步骤 5、用1ml微量移液器将上层水相吸入另一干净的50mL 小烧杯中，加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，使核酸 沉淀下来。 6、用玻璃棒将丝状DNA搅起，转移至10mL70％乙醇中， 浸泡洗涤10分钟。 7、用玻璃棒取出DNA沉淀，室温下干燥。 8、将DNA沉淀溶于1.0 mL TE缓冲液中 实验步骤 试 剂 CTAB分离缓冲液 2% CTAB （十六烷基三甲基溴化铵） 1.4 mol/L NaCl 100 mmol/L Tris-HCl(pH8.0) 异丙醇 氯仿-异戊醇（24：1） 液氮 70%乙醇