实验操作步骤整理.docx

免疫组化1.切片常规脱蜡至水化：烧片80oC，1h；松节油I 20min，II 15min；100%乙醇I 8min，II 5min；95%乙醇I 5min，II 5min；75%乙醇 I 5min，II 5min；蒸馏水 5 min x3; PBS 5min x1.2.失活内源性过氧化物酶3% H2O2 37oC 20min; PBS 5min x3；甩干。3.抗原修复A 9ml+B 41ml+450ml 水（柠檬酸缓冲液）400ml（360水+40）或：Tris-EDTA 修复水浴98oC 15min；室温冷却；PBS 5min x3 甩干4.血清封闭37oC 30min；甩干，不洗。5.一抗（1:200稀释）4oC过夜（或室温2-3h），对照加PBS（稀释比例，来源）6.PBS 5min x4；二抗37oC 30min；PBS 5min x37.SABC染色SABC稀释100倍；990ul PBS +10ul SABC或三抗孵育 37oC 30min.8.DAB染色1ml 水中加1滴A摇匀，加1滴B和1滴C后摇匀，室温1-2min。水：双蒸水；A：浓缩缓冲液；B: DAB；C：H2O2现配现用，配好后遮光，30min内使用，剩余弃去。9.复染清水冲洗，浸于苏木素中1min清水冲洗，盐酸酒精（1ml HCl，100ml 95%酒精）几秒钟返蓝：清水冲洗10min。10.脱水75%酒精1min；85% 1min；95% 1min；100% 4min。11.晾干后封片，标记，观察，截图，分析。常用单位换算1M=1mol/L;1uM=1umol/L;5%琼脂溶液：称取5g琼脂粉溶于100ml生理盐水。5%为质量分数单位，以1L水为1Kg算，则5g每100g即5g每100ml。免疫印迹常用抗原分子量GAPDH 36KDaIGF 95KDaRNA提取准备试剂：氯仿，异丙醇，RNAse-free-ddw(DEPC水)，75%乙醇（ddw配制）。1. 样品处理1）样品处理：取新鲜或-70℃冻存组织，每30-50mg组织加入1ml TRNzol-A+,匀浆处理，样品体积一般不要超过积的10%；2）单层培养细胞：移出培养基，PBS冲洗，加入TRNzol-A+裂解细胞，每10cm2面积加入1ml TRNzol-A+;2. 将匀浆或裂解细胞在15-30℃放置5min，轻轻吹打，使核酸蛋白复合物完全分离；3. 4℃，1400rpm离心，10min，取上清置-80℃冻存；4. 每1mlTRNzol-A+对应至少0.2ml氯仿，盖好瓶盖，剧烈震荡15s, 室温放置3min；5. 4℃，1400rpm离心，10min，样品会分为三层：黄色有机相，中间层和上层无色水相；RNA主要在水相中，把水相（约500ul）转移到新管中。在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20-30min；6. 4℃，1400rpm离心，10min，去上清，离心后RNA位于管壁一侧底部形成胶水样沉淀；7. 加入1ml75%乙醇（DEPC水配制）洗涤沉淀。1ml TRNzol-A+对应1ml75%乙醇；8. 4℃，1400rpm, 10min,倾出液体，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸到沉淀；9. 室温倒置EP管晾干，加入50ulDDW，反复吹打，混匀，充分溶解RNA。Western blot 分离胶：下层分离胶10ml：dH2OArc-bis(30%)4xTris-SDD(PH8.8)AP(10%)TEMED8%4.73ml2.68ml2.5ml100ul4ul10%4.1ml3.3ml2.5ml100ul4ul12%3.4ml4.0ml2.5ml100ul4ul15%2.4ml5.0ml2.5ml100ul4ul上层浓缩胶5ml：dH2OArc-bis(30%)4xTris-SDD(PH6.8)AP(10%)TEMED4%3.04ml0.67ml1.25ml40ul5ul5%2.865ml0.83ml1.25ml50ul5ul厚板是上述的1.5倍：下层分离胶15ml：dH2OArc-bis(30%)4xTris-SDD(PH8.8)AP(10%)TEMED8%7.095ml4.02ml3.75ml150ul6ul上层浓缩胶7.5ml：dH2OArc-bis(30%)4xTris-SDD(PH6.8)AP(10%)TEMED4%4.56ml1.005ml1.875ml60ul7.5ulRunning Buffer(10x, 1L)Tris-base30.3gGlycine144gSDS10g加入DDW补齐到1L。小分子（＜180）Trans Buffer(10x, 1L)Tris-base30.3gGlycine144g加入DDW补齐到1L。稀释用Tr