实验四.免疫印迹.ppt

实验十 免疫印迹（Western bloting) 组成 十二烷基磺酸纳-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 蛋白质转印 固相免疫测定 蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中三种物理效应： ①样品的浓缩效应 ②凝胶的分子筛效应 ③一般电泳分离的电荷效应 电泳分离的电荷效应 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中，由于SDS和巯基乙醇作用，使得蛋白质分子中二硫键还原，氢键、疏水键打开，SDS按1．4gSDS／lg蛋白质的比例结合到蛋白质多肽链分子上，形成SDS—多肽复合物。 十二烷苯磺酸根带负电，使各种SDS—多肽复合物都带有相同密度的负电荷，它的量大大超过了 蛋白质多肽分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质多肽分子间原有的电荷差别 同时，在水溶液中，SDS—多肽复合物具有近似的形状(长椭圆棒状)，并且不同SDS—多肽复合物的短轴长度趋于一 致，而长轴与分子量成正比。这样，SDS—多肽复合物，在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率，不再 受蛋白质多肽原有电荷和形状的影响，而只与其分子量有关，并且在一定条件下与迁移率成线性关系 凝胶的分子筛效应 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(acry1amide，简称Acr)和交联剂亚甲双丙烯酰胺(N,N-methylene bisacry1amide，简称Bis)在催化剂的作用下聚合而成 凝胶聚合时所形成的微孔影响了不同SDS—多肽复合物电泳时的迁移率，即所谓的分子筛效应。微孔的大小由于Bis和Acr的比例和凝胶的浓度决定。 凝胶的浓度与有效分离范围： 样品的浓缩效应 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳使用一种不连续的缓冲液系统,在这一系统中，凝胶分为低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液也有不同的pH和离子强度。 当电泳时，凝胶中样品里的SDS多肽复合物沿移动的界面迁移，在分离胶表面形成了一个极薄的层，极大地浓缩了样品的体积 材料 电泳装置 垂直板电泳槽（水平） 电泳仪 NC膜、Whatman 3MM滤纸 试剂 A液—30%丙烯酰胺储存液 B液 —1.5mol/L Tris-HCl分离胶缓冲液（pH8.8 ） C液 — 0.5mol/L Tris-HCl浓缩胶缓冲液（pH6.8 ） D液 —双蒸水 E 液 — 10% SDS F液 —四甲基乙二胺（TEMED） G液 — 10﹪过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 、上样缓冲液 、印迹电泳缓冲液 、封闭液 、脱色液 方法 SDS凝胶的制备 SDS贮备液（试剂中的A~F液）按比例制备 分离胶(T=12％) 浓缩胶(T=5％ ) 灌胶 灌分离胶 分离胶溶液迅速灌注 ，留出灌注浓缩胶所需的空间（梳子长加1cm） 灌浓缩胶 分离胶聚合完全，灌入浓缩胶并立即插入Teflon梳子（避免气泡）移出梳子，用去离子水洗加样槽 上样、电泳 蛋白质变性 蛋白质样品与上样缓冲液按1:1的比例混合后，100℃加热3min 加样 样品10μl/孔，无蛋白质样品时用上样缓冲液代替 电泳 恒流电泳 ，分离胶中电压提高，溴酚蓝标记移至底部时终止电泳。 印迹电泳 电泳完毕，切胶，剪与胶等大的1张NC膜及6张滤纸 凝胶、NC膜、滤纸、海绵衬垫用印迹电泳缓冲液浸湿 按图所示装好印迹电泳装置，注意蛋白质转移方向 - +，除去膜和滤纸间的气泡 免疫学检测 封闭 加一抗 洗膜 加二抗 洗膜 加底物 试验记录 * * 摇育过夜 摇育2h （3次，每次10min ） 摇育1h *