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第六章 血液代用品 Contents 1 概论 血液的功能 血细胞 常规输血的忧患 血液代用品具有的特点 2 血红蛋白的结构和功能 Hb的组成与结构 血红蛋白的功能 影响血红蛋白对氧亲和力的因素 3 血液代用品的类型 全氟碳化合物 全氟碳化合物— 定义及性质 全氟碳化合物 全氟碳化合物 血红蛋白类血液代用品 天然血红蛋白 血红蛋白类血液代用品 初次离心后的结果 次洗涤后的结果 利用透析袋透析 装配好的凝胶柱 收集得到的纯化后的蛋白 血红蛋白类血液代用品 分子内交联血红蛋白 DCLHb Hemolink 多聚血红蛋白 共轭血红蛋白 化学修饰存在的问题 脂质体包封血红蛋白 脂质体包封血红蛋白 脂质体包封血红蛋白工艺的发展 脂质体包封血红蛋白缺点 基因重组血红蛋白（rHb) 血红蛋白的制备 思考题 ④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。 （2）凝胶色谱柱的装填 50cm高 （3）样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 ②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 ③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） ⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。 （3）样品加入与洗脱 注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。 血红蛋白的化学修饰 目的： 稳定血红蛋白4聚体结构，增加蛋 白相对分子量，以达到降低毒性 的作用。 原理： 表面有许多可修饰的功能基团 类型：分子内交联血红蛋白、多聚血红蛋 白、共轭血红蛋白、脂质体包封血 红蛋白；基因重组血红蛋白 血红蛋白的化学修饰 血红蛋白肽链间的交联，降低氧的亲和力。 试剂：含有负电基团并能结合在血红蛋白中心 腔位置，如双阿司匹林类化合物（3， 5-二溴水杨基双延胡索酸酯），吡哆醛 类化合物。 产品：美国Baxter公司的DCLHb、加拿大 Hemosol公司的Hemolink 血红蛋白的化学修饰 diaspirin cross-linked hemoglobin。用3，5-二溴 水杨基双延胡索酸酯对脱氧的无基质血红蛋白 进行分子内修饰生成α链间交联产物。相对分 子量65000。。 临床：患者出现皮肤黄染、无症状血尿、肠梗 阻发生率显著提高，三期临床死亡率增加，于 1999年终止临床试验。 血红蛋白的化学修饰 O-棉籽糖交联血红蛋白，由各种相对分子量的 聚合、非聚合成分组成，含交联Hb大于95%。 临床：三期已在美国、英国和加拿大开展。不良 反应是血压升高，但在48-72小时内恢复对肝肾功 能无影响。 血红蛋白的化学修饰 分子间修饰主要是形成分子聚合物，从而防止 血红蛋白四聚体的快速解离，延长在血管中的 停留时间。 交联剂主要有戊二醛、乙醇醛、糖醛等。与血红 蛋白反应时无特异 的结合位点，属于多位点修 饰，形成相对分子量不等的交联聚合体，从而 减少溶液中分子数目，溶液渗透压和黏度也随 之降低。 产品：美国Biopure公司的Hemopure和 Northfield Laboratories公司生产的Polyheme 血红蛋白的化学修饰 血红蛋白与天然或者合成的可溶性高分子反应，形成共轭结合物，可以大大增加Hb的稳定性，有效地防止四聚体解离；同时包裹在Hb周围的高分子链覆盖了抗原位点，起到了降低免疫原性，提高存留时间；而且，分子稳定性好，能在循环中维持较高氧含量，并降低网状内皮系统的吞噬，较少可