[基础医学]核酸疫苗及免疫研究进展.ppt

核酸疫苗 Diagram 疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。 人们将多种灭活或减毒疫苗称为第一代疫苗。 将用基因工程的方法研制的亚单位疫苗称为第二代疫苗。 理想疫苗应具备的特征有：安全、廉价、热稳定性好，含有多种具有保护作用的免疫原，最好是一次口服即可生效。目前前两代均不能满足上述标准。故基因疫苗应运而生。 1990年wolff等从事于基因治疗工作时，用外源性重组质粒给小鼠肌肉注射后，质粒被摄取并能在体内至少两个月稳定地表达所编码蛋白。 1991年Williams等发现外源基因输入体内的表达产物可诱导产生免疫应答。 1992年Tang等将表达人生长激素的基因质粒DNA导入小鼠皮内，小鼠产生特异性抗体，从而提出了基因免疫的概念。 1993年Ulmer等将注射技术用于研究流感核酸疫苗，证实核酸注射不但能在体内表达抗原蛋白，还可以诱导具有显著保护作用的免疫应答。 因此，1994年在日内瓦召开的专题会议上将这种疫苗定名为核酸疫苗。 关于核酸免疫的国际会议 1994年5月17-18日，瑞士日内瓦。WHO主办。主题：核酸疫苗。 1995年2月16-17日，美国马里兰州，Bethesda（NIH）。主题：基因疫苗和核酸疫苗战略。 1995年4月6-9日，美国弗吉尼亚州。主题：DNA疫苗：疫苗学的新时代。 1996年2月5-8日，美国马里兰州NIH Natcher会议中心。主题：核酸疫苗预防传染性疾病和控制核酸疫苗。 定义 基因疫苗的构建 基因疫苗的构建 一、构建基因疫苗的载体 载体是将抗原基因导入到机体细胞的必要工具。 1.载体的分类 按照载体功能可分为克隆载体和表达载体； 按照载体来源可分为质粒、噬菌体、黏粒和病毒载体等。 2.常用于构建基因疫苗的载体 pcDNA3.1、pcDNA3.1-E、pcDNA3.1/Zeo（+/-）、 pcDNA4、 pcDNA4/HisMAX、pBudCE4、 pRc/RSV 、 pRc/CMV2等多种 基因疫苗的构建 二、基因疫苗的构建方法 1.抗原基因和载体的制备 获得需要的目的基因常用的方法： （1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库(genomic DNA library)，从中调用目的基因； （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA文库； （3）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。 （4）化学合成 基因疫苗的构建 粘性末端连接 平末端连接 基因疫苗的构建 3.重组质粒转化受体菌 转化：将质粒或者以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 转染：将质粒或者以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。 感受态：细菌经过CaCl2溶液处理和短暂热激后，容易摄入外源DNA，这种状态称为感受态。其原理是细菌处于0℃、低渗CaCl2溶液中时，细胞壁和细胞膜通透性增加。此时转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经短暂的热激（42 ℃ ）处理后，外源基因容易进入细菌细胞内。 常用的方法为氯化钙共沉淀法和电穿孔法。 基因疫苗的构建 4.重组质粒的筛选与鉴定 一般重组质粒鉴定主要按照表型筛选、酶切鉴定和测序鉴定的顺序进行 （1）插入片段鉴定：酶切鉴定；PCR鉴定。 （2）插入片段方向性鉴定：可利用联合酶切方案进行目的基因的插入方向鉴定。 （3）DNA序列测定：末端终止法测序；自动测序仪测序 基因疫苗的构建 三、重组质粒在真核细胞中的表达与检测 1.重组质粒导入真核细胞的方法 磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、脂质体介导等方法都可以用来将外源质粒导入真核细胞，其中脂质体介导容易成功，是最常用的方法。 2.抗原基因在真核细胞中表达的检测 （1）蛋白水平的检测：免疫沉淀法检测表达蛋白；Western印迹检测；酶联免疫吸附测定。 （2）核酸水平的检测：RNA印迹；RT-PCR检测。 基因疫苗经黏膜和皮肤组织免疫的抗原呈递 皮肤或者黏膜是具有高水平免疫监视系统的组织，黏膜淋巴组织的功能：参与粘膜局部免疫应答和产生分泌型IgA。而且在免疫动物时比较方便，尤其是大面积预防时，所以关于基因疫苗通过皮肤或黏膜免疫激活机体免疫反应机制的研究也比较活跃。 基因疫苗经过黏膜和皮肤组织免疫可以分为直接免疫机体和重组减毒胞内菌系统免疫两种形式。 （1）直接免疫 旅美中国科学家范泓然用皮肤涂抹法给小鼠接种