[基础医学]第05章 色谱分析技术和色谱分析仪器.ppt

第五章 色谱分析技术和色谱分析仪器 色谱法（chromatography）是一种物理分离技术，实质上是利用混合物中各个组分在互不相溶的两相（固定相和流动相）之间的分配的差异而使混合物得到分离的一种方法，也有人称之为色层法、层析法等。 色谱仪（chromatograph）的实质是利用色谱分离技术再加上检测技术，对混合物进行先分离后检测，从而实现对多组分的复杂混合物进行定性、定量分析。  色谱分离中的两相是指系统具有一个有大比表面积的固定相（stationary phase）（可以是固体或以某种方式固定了的液体）和一个能携带待分离混合物流过固定相的所谓流动相（mobile phase）（可以是气体或液体）。  色谱工作就是根据被测样品（混合物）的性质，选择适当的两相和其他操作条件，利用分离系统将各个组分分离开来，通过检测系统进行定性、定量分析。具有高分辨率、高灵敏度、样品量少且速度较快、结果准确等优点，是分析混合物的有效方法。 三、色谱仪的分类及其特点1.色谱仪的分类  目前比较成熟的主要是气相色谱仪与液相色谱仪（高效液相色谱仪）两大类。仪器的组成极为相似，主要由流动相供给、进样、分离（色谱柱）、检测、数据处理记录、温度控制和其他控制系统等组成。 五、色谱技术在临床检验中的应用 气相色谱仪常用于人体微量元素的快速分析，血与尿等体液中的脂肪酸、氨基酸、甘油三酸酯、甾族化合物、糖类、蛋白质、维生素、巴比妥酸等化合物的分析，分析鉴定药物的组成和含量、检测人体的代谢产物，通过气相色谱仪串联质谱，在“兴奋剂”检测中可分析100余种违禁药品等。  高效液相色谱仪可以应用在：分析人体体液内正常与异常代谢物质；分析药物的组成和含量，在药物生产中进行中间控制；分析药物在体内的残留量，测定药物在各器官中的代谢产物，进行治疗药物效果的监测（治疗药物检测)；定性测定细胞核中的核苷及核苷酸，分析核酸以及分析氨基酸、酶、糖；激素水平的测定，微生物的鉴定等。 高效液相色谱仪用溶剂作为流动相，需要的样品是液态的，溶剂的选择范围也远远超过了载气，操作基本上可以在室温的条件下完成，比较适合自然状态下大多数样品的分析。 图5-18 复杂样品的不良分离 重叠峰 拖尾峰 t (min) 检测器的响应 R 第三节 高相液相色谱仪 1.程序升温; 第三节 高相液相色谱仪 2.程序变流速; 3.组合柱; 4.梯度洗脱。 梯度洗脱是在色谱的分离过程中，把两种或更多的不同极性互溶洗脱液随时间按某种变化的比例混合，使流入色谱柱的洗脱液组成作连续的改变。其目的是让样品每个组分都在最佳分配系数的条件下分离出来，以获得较好的峰形。 梯度洗脱分为内梯度洗脱（高压）和外梯度洗脱（低压）两类。 第三节 高相液相色谱仪 第三节 高相液相色谱仪 图5-19 梯度洗脱装置原理示意图 液A 比例阀A 液B 比例阀B 混合器 高压泵 色谱柱 液A 泵A 液B 泵B 混合器 色谱柱 (a)外梯度洗脱 (b)内梯度洗脱 （三）流量控制器 高压的流动相流经色谱柱时，与固定相产生相互作用，固定相会形成一个与流动相流动方向相反的作用力，即构成一个与流向相反的压力，称之为柱反压，它将阻碍流动相的正常流动。流量控制器是为消除色谱柱反压过高对分离造成的不良影响而设计的。 第三节 高相液相色谱仪 二、进样系统  高效液相色谱仪的进样系统，要求能将样品有效地注入到系统里去，而不破坏在色谱柱和检测器里所建立的流量平衡。理想的进样系统应能给系统带来最低限度的死体积。否则，柱效率将受到损失。 第三节 高相液相色谱仪 进样装置有注射器和多通进样阀。为适应高压条件下进样，进样方式又有停流动相和不停流动相进样两种方式。（一）注射器进样 高效液相色谱仪进样量一般都比较小，因而注射器进样常采用微量注射器。可分为直接注射器进样与隔断式注射器进样两种。 第三节 高相液相色谱仪 直接注射器进样与气相色谱仪相类似。进样时注射器直接插入色谱柱上端的进样器隔膜，将样品注入到色谱柱中固定相的顶端。其结构简单，使用方便，可在不停流情况下进样。但对隔膜、弹性垫片要求耐压高，一般在压力低于14.71MPa时可以使用。 第三节 高相液相色谱仪 导向头 洗脱液 色谱柱 亚硝基氟橡胶密封圈 图5-20 隔膜注射进样器 第三节 高相液相色谱仪 为了使注射器进样适应更高压力，可采用隔断式进样器。它在不进样时用隔断器将进样系统与流动相隔断开。进样时将隔断器提起，让进样系统与流动相连通，同样将注射器针头插到色谱柱顶端进样，流动相带着样品进入色谱柱，进样完毕马