[理化生]12基因工程基本操作程序.ppt

以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤 一、 待测核酸样品的制备 （一）制备待测DNA 将基因文库中的所有菌落裂解，用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA （如量不够可用PCR扩增） （二）DNA限制酶消化 基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。消化后电泳分离DNA （三）DNA变性：分离后移至于碱性溶液中浸泡，DNA片段经过碱变性作用，形成单链状态。单链DNA片段转移到固相（一种特制的膜）支持物上 。 以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤 二、探针标记：通过PCR方法将目的基因已知的部分核酸序列扩增出来，进行放射性同位素标记，即用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针，将标记的DNA探针置沸水浴10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性成单链。 三、Southern杂交 ：将待测单链DNA滤膜和标记的探针单链DNA放入杂交液中即可进行杂交反应。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。 以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤 四、放射性自显影检测 将杂交后的滤膜，放入有2张X光底片暗盒中，使滤膜对X光底片曝光然后冲洗X光底片，在膜上阳性反应（杂交带）。 主要应用 1.遗传病诊断 2.DNA图谱分析 3.PCR产物分析 例： 若通过基因过程生产人的糖蛋白可以用大肠杆菌作为工程菌吗？ 答：不可以，糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成，而内质网和高尔基体存在真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含这两种细胞器。 以酵母菌作为工程菌可以吗? 答：可以，酵母菌为真核生物（真菌类）。 四 目的基因的检测与鉴定——检查是否成功 导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组 DNA分子吗？ 真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。 目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持 和表达？ 不一定，需要检测 1.检测方法： 分子杂交技术： （1）DNA分子与DNA分子的之间杂交 （2）DNA分子与RNA分子的之间杂交 （3）蛋白质分子（抗原与抗体）之间杂交 2.个体生物学水平的鉴定： 抗虫、抗病结种实验，活性比较实验 1.检测 转基因生 物的DNA 探针 15N 15N 14N 14N （1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了 目的基因 基因探针： 放射性同位素等标记的DNA分子 方法： DNA分子杂交技术 变性 变性 如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因。 变性 方法： DNA分子杂交（northern杂交） （2）检测目的基因是否转录出了mRNA 探针 15N 15N 转基因生物 的mRNA 14N 14N 如果显示出杂交带，就表明待测样品目的基因已经转录。 提取 （3）检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法：抗原-抗体杂交 苏云金杆菌 Bt毒素蛋白 将Bt毒蛋白注射小鼠体内 从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体 抗体 蛋白质 出现杂交带 脱分化 组织培养 证明：提取蛋白质与Bt毒素蛋白质一样 例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。 2.鉴定——个体生物学水平的鉴定 （1）多细胞个体 抗虫、抗病接种实验，活性比较实验 不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。 受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？ 若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。 细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。 （2）单细胞生物 无表达产物 无表达产物 有表达产物 无表达产物 1、有关基因工程的叙述中，错误的是( ) A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、人工合成目的基因不用限制性内切酶 课堂练习 2、下列属于获取目的基因的方法的是( ) ①利用mRNA反转录形成 ②从基因组文库中提取 ③从受体细胞中提取 ④利用PCR技术 ⑤利用DNA转录 ⑥人工合成 A.①②③⑤ B.①②⑤⑥ C.①②③④ D.①②④⑥ 课堂练习 3、有关基因工程的叙述正确的是 （