[理学]第三章 蛋白质一级结测定.ppt

第三章 蛋白质一级结构测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。 蛋白质的一级结构 蛋白质的一级结构(Primary structure)包括： 1、组成蛋白质的多肽链数目. 2、多肽链的氨基酸顺序， 3、多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。 （一）蛋白质测序的策略 测定蛋白质的一级结构的基本要求： 1、样品必需纯（97%以上）； 2、知道蛋白质的相对分子量。 蛋白质一级结构测定的步骤 1、测定蛋白质多肽链数目 2、拆分蛋白质分子多肽链 3、断开链内二硫键 4、分析每一多肽链氨基酸组成 5、鉴定多肽链N-末端和C-末端 6、多种方法的部分水解，分离水解后得到的小片段多肽 7、测定上述小片段多肽的序列 8、利用交叉重叠法拼出一条完整多肽链 9、确定二硫键位置 测定步骤 1、测定蛋白质分子中多肽链的数目。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。 测定步骤 2、多肽链的拆分。 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体。 可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基). 测定步骤 3、二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的?-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。 4、测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比； 进行完全水解后用氨基酸自动分析仪测定 测定步骤 5、分析多肽链的N-末端和C-末端。 多肽链末端氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。 N末端和C末端残基鉴定 N末端： 1、DNFB（Sanger）法 2、丹磺酰氯（DNS）法 3、PITC（Edman）法 4、酶法 C末端： 1、肼解法 2、酶降解法 Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸，其余为游离氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法（层析法）进行鉴定。 Sanger试剂(FDNB)标记N末端 在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1?10-9mol。 （3）苯异硫氰酸酯法（PITC法） 氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。 此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。 C末端的肼(hydrazine)法测定 蛋白质与无水肼加热 -------NH-CH-CONH-CH-COOH | | Rx Ry -- -- NH-CH-CONH-NH2 + NH2-CH-COOH | | Rx Ry 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。 测定步骤 6、多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。 ? 酶解法: 胰蛋白