[农学]第四章 核酸操作的基本技术.ppt

第四章 核酸操作的基本技术 新疆农业大学农学院 第四章 核酸操作的基本技术 核酸的操作技术是基因工程最基本的技术之一 在基因工程技术中，研究的对象和材料都涉及到核酸 核酸技术包括：核酸的提取与纯化、检测与保存、凝胶电泳、分子杂交等 第一节 核酸的提取与纯化 制备核酸的根本要求：保持核酸的完整性，既保持天然状态 细胞内核酸酶活力很高，防止核酸酶对核酸的降解 防止化学因素（酸、碱等）和物理因素（高温、机械剪切等） RNase分布广，活力很高（RNA) DNA分子长、容易断裂，防止张力剪切作用 第一节 核酸的提取与纯化 提取纯化核酸分为三大步 细胞破碎 除去与核酸结合的蛋白质及多糖脂等杂质 除去其他杂质核酸 一、基本原理 （一）化学试剂提取法 CTAB法 SDS法 （二）离心分离法 （一）化学试剂提取法 CTAB法 CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。 （一）化学试剂提取法 SDS法 研磨的组织细胞用热的SDS（十二烷基硫酸钠）裂解后，加入高浓度的KAc，0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质，最后用乙醇或异丙醇沉淀。 （二）离心分离法 根据核酸长度大小的不同进行纯化 超速离心 凝胶电泳 超速离心 根据样品的质量来进行分离，称为速度区带离心 沉降的速度与样品的质量、密度、离心力大小、介质的摩擦力大小有关。 根据样品的密度大小不同而进行分离，称为密度梯度离心 质量和密度大的颗粒比小的沉降快，介质密度与样品的密度相等时，样品停止移动，停留在该介质密度的位置上 氯化铯密度梯度离心法 溴化乙锭(EB)是一种吖啶类染料，它可以插入DNA的碱基对之间，使DNA的体积增大，浮力密度变小。EB容易插入线状的DNA，而与环状质粒DNA的结合量小于与线状染色体DNA的结合量，从而使两者的浮力密度出现悬殊的差别，更利于离心时分离。 氯化铯密度梯度离心法 CsCl是一种高分子量的重金属盐。在高速离心条件下，就会在离心管中形成CsCl密度梯度。将DNA样品加EB与 CsCl一起离心，当DNA的沉降速度与扩散速度达到平衡状态时，DNA就形成一稳定的区带。在合适的CsCl密度梯度范围中，DNA就处在一定的位置上，这时DNA的浮力密度就等于该位置上的CsCl的密度。由于质粒DNA的浮力密度大于线状染色体DNA的浮力密度，染色体DNA的区带在上层，质粒DNA的区带在下层。两者能明显地分开而达到分离的目的。 氯化铯密度梯度离心法 在提取的样品中，还含有大量RNA。一般来说，DNA与 RNA的浮力密度是与CsCl、H20相互作用有关，而RNA在 CsCl中总是与Cs+相结合，故密度很大。在超速离心时， RNA将沉入离心管底，这样就可以与质粒DNA相分离。 （三）一般过程 供体细胞培养 收集(菌体)细胞 细胞破碎 分离总DNA 分离细胞器 分离总RNA 分离细胞器DNA RNA poly(A)RNA 特异性RNA 染色体DNA(组建基因组文库) ? DNA分离纯化过程 ①苯酚抽提法 ② CsCl密度梯度离心 上清液 加入固体CsCl与EtBr溶液 室温下超速离心(45,000rpm）16小时 穿孔取出DNA（320nm） 异丙醇抽提溴乙锭 缓冲液透析除去残余CsCl 两倍体积冷乙醇沉淀DNA 离心、洗涤、干燥 细胞器DNA的分离 质粒载体DNA的分离 关键：如何使质粒DNA与宿主染色体DNA分开 原理：质粒DNA比染色体DNA 小得多，在DNA抽提过程中，染色体DNA断裂成小片段(线状)，质粒DNA仍保持超螺旋构型 质粒载体DNA的分离 超速离心：利用两种DNA分子的大小和空间构型 变性法：在变性条件下使染色体DNA变为单链，而质粒DNA仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前者仍不能复性，而