[工程科技]色谱分离技术.ppt

（二）色谱分离过程的特点 应用范围广 分离效率高 操作模式多样 高灵敏度在线检测 柱效应 衡量色谱柱效率一般使用塔板高度和、塔板数，实际工作中以下时计算塔板数（N）： （二）、色谱理论模型 ? 轴向扩散理论 是Amudson等在大量实验的基础上提出的 理论认为：在色谱过程中，组分在流动相中的轴向扩散 影响色谱区域谱带扩张的主要因素，而有限的传质速率 对区域谱带扩张没有影响。 基本方程为： 如上图所示， EBA工作过程为： 凝胶颗粒在向上的流体作用下向上扩展 当向上的液体流速与凝胶颗粒的沉降速度达到平衡时，凝胶颗粒处于平衡悬浮状态，这时形成稳态流动柱床，柱塞的位置处于柱床的顶部 接着将经离心、澄清过滤等处理的样品液以上向注入柱床，目标蛋白质吸附在凝胶颗粒上，而有形颗粒直接穿 过柱床 柱床随着液相上向流动而得到冲洗，未被吸附的物质都 流出床层，这时停止上向流动液体，凝胶颗粒沉降下来，柱塞也逐渐下降至沉降床层表面 然后以洗脱液下向流动进行洗脱，得到目标蛋白质的浓缩液，以便进行进一步纯化工作 洗脱完成后，用适当的缓冲液对柱床进行再生。 ? EBA色谱的应用 从S.cerevisiue匀浆液中提取葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH） 洗脱过程中需从柱顶部向床层通入洗脱液，此例中以梯度洗 脱方式洗脱吸附的G6PDH,洗脱液流速保持在152cm / h ，洗脱液梯度组成为： 50mM盐酸三乙胺溶液，pH8.0 含NaCl（100mM）的50mM盐酸三乙胺溶液，pH8.0 含NADP（10mM）的50mM盐酸三乙胺溶液，pH8.0 含NaCl（2M）的50mM盐酸三乙胺溶液，pH8.0 大规模质粒DNA的提取 Hanak等人采用EBA色谱提取质粒DNA（p DNA），规模达到kg级的E.coli细胞湿重。 具体作法为：首先将E.coli菌体破碎，进行DNA和pDNA的初步分离，然后将含pDNA的混悬液直接进行EBA色谱提取，制备出了符合基因治疗用药标准的pDNA 。而采用其它方法则提取难度大，成本高，不易规模化，不能满足pDNA的用量需求 (三）、制备型超临界流体色谱（Pre-SFC ） ? 原理及特点 优势 在Pre-SFC中，通过改变流动相温度或压力即可改变其密度，色谱分享的特性就会随之改变，这样一种单一的流动相就可以用于多种用途的分离，而无需为柱平衡耗费时间，这在以溶剂为流动相的色谱方法中是难以做到的 收集的馏分中的流动相容易去除，通过简单的降压就足以将SF-CO2气化 流动相回收简便。收集气相CO2，通过一定设备净化后可使其重返超临界状态，循环使用，由于CO2易于回收、成本低廉，使Pre-SFC对工业极具吸引力，尤其是在生产成本中流动相占最大比例的情况下 局限 技术相当昂贵。例如色谱柱的设计：色谱柱应能承受相当高的压力变化（如300bar~4,500 psi ），而且在色谱柱承受增加的压力时要防止对填料的损坏。目前特殊的动态轴向压缩柱也满足此要求，但也不能完全解决费用昂贵的问题。 超临界CO2的溶解性能不可能溶解所有物质，通常需加入改良剂改善溶解性能，但同时部分抵消了其一些优势 ? 操作的特殊点 上样量主要受样品在超临界流体中溶解度的影响，而不是 色谱柱的负载量 一种方法是使用前置柱上样 另一种方法是对以上方法的改进 ? 超临界模拟移动床色谱（SF-SMB） 在SMB色谱系统 ，当以超临界流体为流动相，通过调节操作压力就可以进行梯度操作，因为调节压力就改变了超临界流体的溶解性能，因而相当于改变了流体组成，这就是SF-SMB 色谱 Novasep公司的许多研究表明，SF-CO2-SMB应用于植物萃取物的纯化取得了极好的结果，而且已在几个制药企业实现工业化应用 ? Pre-SFC的应用 Pettinello等利用一根装填硅胶的色谱柱（520X100m，I.D.） 进行中试规模Pre-SFC分离，其装置流程图如下： 分离极性化合物 赵锁奇等采用全多孔空白硅胶为固定相，二氧化碳加极 性携带剂及酸碱性改良剂为三元流动相，在自建的一套 克级Pre-SFC装置上，成功地对黄酮类物质和生物碱混 合物进行了分离 （四)、制备型加压液相色谱（pre－PLC） 一般为间歇式操作：间歇上样，即样品进入色谱系统后，必 须完全流出色谱柱后才能进行下一次的分离纯化过程。 样品溶液由柱顶端加入色谱柱中，用泵连续输入流动相，样 品溶液中溶质在流动相和固定相之间进行扩散传质，由于溶 质各组分在两相间分配情况不同，造成各组分在柱中移动速 度不同而得到分离。柱出口流出液经检测器检测，通过色谱