4层析法生化分析.ppt

第四章 层析法 1. 凝胶过滤层析的基本原理 凝胶颗粒具有三维网状结构，可对大小不同 的分子流动产生不同的阻滞作用。 颗粒粒径：几十~几百μm 间隙：几~几十μm 孔隙的孔径：nm级 固定相（凝胶） 基本概念 外水体积（Vo）：凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即凝胶 颗粒间液体流动相的体积。 内水体积（Vi）：凝胶颗粒中孔穴的体积，即凝胶层析中固定相 的体积。 基质体积（Vg）：凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积（Vt）：凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积（Ve）：将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积 每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数 Ve=Vo+KdVi 要分离的分子分为三类： A类：比孔径大的分子，全排出 凝胶，无阻滞，最早流出； C类：较小的分子，能进入全部 孔隙区，阻滞最大，流速最慢， 最晚流出； B类： dC﹤dB﹤dA ，在流动中 部分渗透，渗透程度取决于分子 的大小，流出时间介于两者之间 葡聚糖凝胶（G类）的规格 聚丙烯酰胺凝胶： 并非天然产物，是通过化学方法合成的。 商品名：Bio-Gel P 商品型号：P-2至-300 型号含义：排阻限度，×1000相当于允许进入凝胶内部蛋白 质的最大分子量。数字越大表示交联度越小，可分离的分子 量越大；而数字越小则交联度越大，可分离的分子量越小。 特点：理化性质稳定，抗微生物侵袭能力较大，适用于配基 和亲和物之间亲和力比较弱的系统，应避免在pH2-11以外的 溶液中长期使用。 聚丙烯酰胺凝胶的性质 琼脂糖凝胶： 商品名称：Sepharose（瑞典，pharmacia） Bio-Gel-A（美国，Bio-Rad） 型号：2B，4B，6B; Bio-G 0.5M，1.5M，5M，15M，50M，150M。 型号含义：琼脂糖浓度为2%，4%，6%; 阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。 特点：亲水性强，理化性质稳定，网孔大，非专一性吸附 小，只能以湿态保存，经不起有机溶剂处理。温度稳定范围 较窄，低于0℃会使颗粒结构遭受不可逆的破坏，而高于40℃ 凝胶会熔解。因此不能用高温灭菌，可采用化学方灭菌。适 合于组分分子量差异较大的混合物的分离。 生物样品常见的两种分离形式 分组分离：将样品混合物按相对分子质量大小分成两组，一组较大，一组较小，使大分子完全排阻而小分子完全渗透。 选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。即大分子的分配系数Kd= 0，小分子的Kd＝1。这样能取得最好的分离效果。 分级分离：将一组相对分子质量比较接近的组分分开。 选择凝胶型号时必须使各种物质的Kd值尽可能相差大一些。决不能使它们的分子量都分布在凝胶分离范围的一侧，也就是Kd不要都接近于0或1，而要使组分的分子量尽可能分布在凝胶分离范围的两侧，或接近两侧的位置。 （2）凝胶的预处理 使用前须溶胀，使干胶颗粒充分吸收溶剂，并达到平衡。 室温下干胶以10倍以上吸液量的溶剂浸泡。 热法溶胀：将干胶往水里加，边加边搅，以防凝胶结块，然后放到沸水浴中加热接近100℃，几个小时就可以使其溶胀，还可起到除去颗粒内部气泡和杀菌作用。 纯化、排除气泡 葡聚糖凝胶（G类）的规格 （3）层析柱的选择 柱比：层析柱长度与直径的比值 对于分组分离，柱床体积一般为样品溶液体积的5倍，柱比5:1到10:1即可。 对于分级分离，要求柱床体积大于样品体积25倍以上，甚至多达100倍。柱比在25:1至100:1。 （4）洗脱液的选择 洗脱液的作用：消除组分与固定相的吸附等相互作用，并不改善分辨率。 洗脱液的选择：主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶过滤。 常用0.02-0.15mol/L离子强度的缓冲盐溶液 （6）加样 加样要尽量快速、均匀。 分级分离：加样体积一般为柱床体积的1-5% 分组分离：加样体积一般为柱床体积的10-25% （7）洗脱速度 要恒定而且合适。 凝胶的线流速一般为2~10cm/h （8）凝胶的保存 保存：反复洗涤去除蛋白等杂质后，加入抗菌剂（常用0.02%的叠氮化钠），4℃保存。 长时间保存：水洗后滤干，依次用50、70、90、95% 乙醇脱水，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。不能将溶胀的凝胶直接高温烘干！ 凝胶过滤层析 优点：设备简单、操作